流式细胞仪原理及应用(HIV)课件

1、碧迪医疗器械（上海）有限公司(yu xin n s)上海市静安嘉里中心3座10楼李苏辉流式细胞仪原理(yunl)及仪器维护保养第一页，共五十三页。白细胞的组成(z chn) 白细胞的组成及其分化抗原白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志(biozh)。1986年世界卫生组织命名委员会建议应用CD系列来统一命名白细胞分化抗原白细胞（CD45)淋巴细胞单核细胞(CD14/15)粒细胞(CD15)B cell（CD19等）NK cell（CD16/56) T cell (CD3)嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞中性粒细胞巨噬细胞Th cell(

2、CD4)Tc cell(CD8)第二页，共五十三页。SHA- LF4N 13E for Jerel细胞毒性T淋巴细胞;分泌(fnm)穿孔素、IFN、TNF等。特点：MHC-1类分子限制、直接接触、反复杀伤自然杀伤细胞（NK)：抗体依赖(yli)细胞介导的细胞毒作用、淋巴因子介导细胞毒作用、抗体依赖的细胞(xbo)介导的细胞(xbo)毒作用补体系统的活化（经典、凝集素、替代途径）。作用（溶胞作用、吞噬条理作用、趋化性、 炎症反应等）中和抗原：形成免疫复合物，被吞噬细胞清除（条理作用）、毒素中和作用、感染中和作用体液免疫和细胞免疫的作用淋巴因子依赖的细胞毒作用第三页，共

3、五十三页。免疫应答的过程及Th细胞(xbo)的作用 免疫应答：细胞(xbo)免疫体液免疫Th细胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可诱导Th、Tc分裂增值； Th2分泌IL-4、IL-5,可使B细胞活化，产生抗体B细胞完全活化需要Th帮助 第四页，共五十三页。流式细胞仪原理(yunl)流式细胞术(Flow cytometry)对于处在流动状态的细胞(xbo)或生物颗粒同时进行多参数的快速的分析和定量的技术第五页，共五十三页。BD公司(n s)HIV领域流式细胞仪产品FACSCount流式细胞仪FACSCalibur流式细胞仪第六页，共五十三页。TTCHCD3CD3CD8CD4流式细胞仪检

4、测原理(yunl)及在T细胞分析中应用第七页，共五十三页。AnalyzeIncubate第八页，共五十三页。激发光源与荧光(ynggung)标记物第九页，共五十三页。FACSCalibur流式细胞仪仪器(yq)结构液流系统光学系统激光光源(gungyun)光收集系统电子系统光电转换数据处理系统软件系统第十页，共五十三页。液流系统(xtng)-鞘液第十一页，共五十三页。流式细胞仪原理(yunl) Injector Tip荧光信号及前向角、侧向角散射光聚焦的激光光束鞘液第十二页，共五十三页。光学系统激光 (Laser, light amplification by stimulated emiss

5、ion of radiation)是一种相干光源，它能提供单一波长(bchng)、高强度及稳定性高的光照激光波长: 488nm, 635nm第十三页，共五十三页。检测(jin c)信号 散射光信号FSC: 前向角散射光SSC: 侧向(c xin)角散射光(90度散射光) 荧光信号荧光染料光学滤片第十四页，共五十三页。检测(jin c)信号第十五页，共五十三页。FALS SensorLaser前向角散射光信号(xnho) 第十六页，共五十三页。前向角散射光信号(xnho)第十七页，共五十三页。 散射光信号(xnho)前向角散射光信号(FSC)FSC-Forward (Angel Light) S

6、catter在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FSC的强度与细胞(xbo)或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关FSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小 第十八页，共五十三页。FALS Sensor90LS SensorLaser侧向(c xin)角散射光信号第十九页，共五十三页。侧向(c xin)角散射光信号第二十页，共五十三页。 侧向(c xin)角散射光信号(SSC)SSC-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SSC的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及

7、 optical homogeneity 有关(yugun)SSC用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少, 核质比 第二十一页，共五十三页。流式细胞仪的检测(jin c)信号：散射光FSC，前向角散射光，代表细胞大小(dxio)SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source第二十二页，共五十三页。荧光(ynggung)信号每种荧光染料均有特定(tdng)的激发波长, 并激发后会有发射波长,

8、流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号第二十三页，共五十三页。光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜(tujng), 滤波片, 小孔组成第二十四页，共五十三页。光路 - 滤片特性(txng) 长通滤片 允许长于(chngy)设定波长的光通过 短通滤片 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 允许一定带宽的波长通过第二十五页，共五十三页。460 500 540460 500 540460 500 540SP 500LP 500BP500/50 长通 短通 带通光学(gungxu)滤片第二十六页，共五十三页。荧光(ynggung)信号第二十七页，共

9、五十三页。荧光(ynggung)信号第二十八页，共五十三页。 光路 - 滤片特性(txng) 当以 45o 角放置长通滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 这种方式(fngsh)的滤片称为二向色性长通滤片( dichroic filter) 第二十九页，共五十三页。第三十页，共五十三页。光学系统第三十一页，共五十三页。电子系统当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受激激发, 产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号, 这些(zhxi)信号经A/D转换成数字信号, 送计算机进行储存、 作图、 统计分析第三十二页，共五十三页。发射(fsh)波长Wavel

10、ength (nm)40045050055060065070010008006004002000PEFITCPerCP750第三十三页，共五十三页。流式细胞仪原理(yunl)荧光(ynggung)信号650nm700nmFL3650 and Above500nm600nmFL1530/30FL2585/42Relative IntensityFITCPEPerCPWavelength (nm)550nm第三十四页，共五十三页。检测器Photomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字(shz)数据)信号 第三十五页，共五十三页。单平台(pngti)绝对计数管中预先

11、(yxin)加有准确定量的Beads流式细胞仪获取数据后，由各目标群的含量，可以计算出相对含量%由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量计算公式： 细胞获取数Beads总量细胞/L= Beads获取数 样本量注：Beads总量见TruCOUNT管外包装MultiSET系统中，样本量为50 L第三十六页，共五十三页。单平台绝对(judu)计数使用(shyng)TriTEST或MultiTEST试剂，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴细胞绝对计数TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致由各目标群与Beads的相对量计算，得到该

12、细胞群的绝对含量使用直接荧光标记抗体组合，一步处理外周血使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本操作简便，省时省力，计数结果重复性好第三十七页，共五十三页。淋巴细胞分析(fnx)使用(shyng)特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析淋巴细胞分析TriTEST：三色试剂CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45MultiTEST ：四色试剂CD3/CD8/CD45/CD4TruCOUNT：单平台绝对计数管报告Th,Ts,Th/Ts百分含量%与绝对含量cells/uL第三十八页，共五十三页。TriTEST CD4/CD8/CD3

13、T Lymph EventsCD3+CD4+ %T LymphCD3+CD8+ %T LymphCD3+ CD4+CD8+%T LymphT H/S RatioBead EventsCD3+ Abs CntCD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+ Abs CntCD3+CD4+CD8+ Abs Cnt第三十九页，共五十三页。淋巴细胞四色分析(fnx)Lymph Abs CntCD3+ % LymphCD3+ Abs CntCD3+CD4+%Lymph CD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+ Abs CntCD3+CD4+CD8+%LymphCD3

14、+CD4+CD8+ Abs CntT H/S Ratio第四十页，共五十三页。MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19第四十一页，共五十三页。FacsCalibur仪器样本(yngbn)操作仪器(yq)校正：加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样。样本操作：溶血、有凝块的血不要做 加样前，抗凝血颠倒混匀810次（避免混匀器混匀） 使用反向加样法，枪头贴壁。加样枪在试管内不要放松 第四十二页，共五十三页。FACSComp没有(mi yu)通过怎么办？FSC或SSC没有通过：原因：1.由于仪器的管路没有清洗干净2.使用的鞘液

15、杂质太多(换鞘液）BD公司专用(zhunyng)鞘液3.校准品失效4.仪器故障措施：1. 用蒸馏水高速运行仪器10分钟30分钟2. 过滤鞘液3. 使用新的校准品4. 致电BD工程师第四十三页，共五十三页。FacsCalibur仪器(yq)BD原装鞘液：过滤、消毒。0.22um滤膜过滤鞘液桶放入3升鞘液（不要放满），清除(qngch)废液桶废液，装200毫升漂白剂先开仪器再开电脑在按Prime按钮去除流动池气泡时，上样架处在偏离位置做好每日维护，建议每次关机时做FacsClean和FacsRinse清洗。（1） FacsClean，Run Hi 支架旁位2分钟；支架正位3分钟 （2） FacsR

16、inse，步骤同上 （3）蒸馏水， Run Hi2分钟旁位，5分钟正位（4）去除鞘液压力（5）选择Standby模式10分钟后关机 月维护中鞘液桶装入FacsClean (0.51的漂白剂)，旁路鞘液过滤器。每3个月6个月清洗空气过滤网（用水冲洗再晾干）。过滤器6个月更换第四十四页，共五十三页。FACSCount第四十五页，共五十三页。仪器(yq)性能样本(yngbn)稳定性制备后室温(2025 0C)储存48小时全血稳定性采集后室温(2025 0C )储存48小时第四十六页，共五十三页。FacsCount样本(yngbn)处理FacsCount质控：正常血，样本用前颠倒混匀（避免混匀器上混匀

17、）。反向(fn xin)加样法，枪头贴管壁,分离最后一滴。试剂在开盖前可以在混匀器上颠倒混匀每次更换枪头，样本多时，每次更换试剂对管管盖加入固定液后30分钟以后再操作更安全第四十七页，共五十三页。FacsCount仪器(yq)用水冲洗开盖器，用轻柔的去污剂或70酒精清洗电子加样枪,用1：10的漂白剂清洗Workstation避免在废液桶里装高浓度的漂白剂每次试验结束后废液桶必须清空,然后用自来水冲洗.建议关机后取出废液桶,下次实验时再放置在仪器里电子加样枪不用时需从支架上取下.软盘复制（已做过质控的软盘作为母盘）连续做15个标本需要(xyo)做清洗，如果试验中间中断1小时以上，需要清洗；将装有

18、蒸馏水的上样管置于上样针位置，保持上样针湿润，防治结晶；关机。如果长时间不做试验，建议每周用蒸馏水清洗第四十八页，共五十三页。FacsCount仪器(yq)FacsCount的每日维护；1.运行CLEAN程序，2.上样管放置稀释(xsh)的FacsClean（稀释10倍次氯酸钠） 3分钟3.再放置装有FacsRinse（Tween 稀释10倍1/00%)上样管清洗3分钟4.重新执行CLEAN程序，FacsRinse （Tween 稀释10倍1/00%)再洗3分钟5.放置装有蒸馏水的上样管清洗3分钟6.试验结束后，放置装有蒸馏水的上样管浸泡上样针，避免管道结晶6.仪器无用时建议取出废液桶第四十九页，共五十三页。FacsCount仪器(yq)FacsCount的长冲洗；1.短路过滤器,并在鞘液桶内和试管中放置稀释5倍的次氯酸钠2.运行CLEAN程序(二个循环)后进入UTILITY程序，