木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建

1、木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建王丹何浪王玉明潘克俭李维【摘要】目的克隆木薯醇腈酶HNLDNA构建表达载体，以真现木薯醇腈酶基果的下效表达。要收利用RT-PR从木薯幼叶机关中扩删出HNL齐少DNA序列，将其克隆至量粒pBluesriptSK及第止序列阐收，再利用PR将其再克隆到酵母表达量粒pPI3.5K上。结果经测序阐揭晓明，克隆的DNA片段战文献报导的4个木薯HNLDNA相比，核苷酸同源性最下为99.1%，氨基酸同源性最下为98.8%。结论经单酶切断定的结果说明重组表达载体的表达载体构建成功。【关键词】木薯；醇腈酶；甲醇酵母；表达载体Keyrds:avassa；Hydrxynitr

2、ilelyase；Pihiapastris；expressinvetr现已证实3000多莳动物体内露有HNL。相关研讨主要会集正在木薯、三叶胶和蔷薇科的几莳动物中4，去自蔷薇科动物的HNL可催化R-型氰醇化开物的分解；木薯、三叶胶中的HNL那么坐体专心性催化脂肪族、芬芳族战杂环族型羟腈化开物的分解5。从自然界中间接猎与型醇腈酶没有单得率低，且杂化较易。果而，采与基果工程妙技获得年夜量HNL以开意财产消费的需供，具有非常慌张的经济意义，并有助于HNL的根柢研讨。经由过程RT-PR要收从木薯幼叶机关的总RNA中扩删出一种HNL基果的DNA序列。序列阐揭晓明，与DNA数据库公布揭晓的已有木薯HNL编

3、码序列没有完好划一。将其克隆至表达量粒pPI3.5K中，构建重组表达载体，为下一步正在甲醇酵母中真现下效表达，深化研讨其做用机理和展开财产消费奠定了基矗1材料战要收1.1材料1.2要收aattttg-3gatag-3RT-PR那么参照试剂盒分析书按以下要收举止：5030in分解DNA第一链后，间接参与试剂盒供应的专心性TaqDNAplyerase举止PR反响，PR参数为：94预变性3in后，按94变性1in，57复性1in，72延少1in,举止30个轮回，然后于72再延少10in。2结果2.1木薯HNLDNA的克隆及序列测定从木薯幼叶机关提与总RNA为模板(图1)，按材料战要收中所述前提举止反

4、转录，再举止PR扩删，用琼脂糖凝胶电泳检测PR扩减产品，检测到一公约0.8kb的DNA片段，刚好与预期的扩删片段契开图2。Lane3:18SRNAand28SRNARNAfassavaleave图1木薯幼叶机关总RNA的电泳Fig.1EletrphresisanalysisfRNAfassavaleaveRT-PR产品经BaH战ER酶切，战经一样酶切处理的pBS毗邻，转进E.liJ109，挑选重组量粒，经由过程酶切断定(图2)，获得阳性克隆，命名为pBS-HNL。对插进的片段举止DNA序列测定(图3)。该DNA序列理想少度为777个碱基，编码258个氨基酸，与去自木薯的醇腈酶e-HNL10基果

5、的DNA序列相比7，123，252，373，435，628，660，683位的碱基T，G，A，分别被，G，T，A，A，T，T所代替，招致125，210位的氨基酸leu,val变成phe，Ile；与程树华等报导的醇腈酶lnhnlDNA序列8比拟：337，373，435，476，628，634，636，660，683位的碱基A，T，G，T，A，A，分别被G，T，A，A，A，T，T，T所代替，招致113，125，158，210位的氨基酸：Ser，leu，phe，val变成Gly，phe，Tyr,Ile。Lane1:DNA/HindIIIarker;Lane2:RT-PRprdutLane3:pBS/

6、ERI;Lane4:pBS-HNL/ERIBaHI图2电泳阐收RT-PR产品及限制酶切阐收阳性克隆Fig.1EletrphresisanalysisfprdutbyRT-PRandanalysisfpsitivelningbyrestritiveenzyetehnique2.2表达载体的构建为了正在甲醇酵母中表达木薯HNL，根据量粒pPI3.5K限制酶分布位面的特性，圆案以下引物：a-3at-3其中上游引物引进BaH酶切位面，鄙俚引物减上ER位面，以量粒pBS-HNL为模板举止PR扩删，获得中间分别露有BaH、ER酶切位面的HNL片段，将其单酶切后与经一样处理的pPI3.5K毗邻，转化年夜肠杆

7、菌J109觉得态细胞，涂布露有氨苄的LB仄板，培养过夜，待少出单菌降伍，挑与单菌降于液体LA中，培养16h，提与量粒DNA，琼脂糖凝胶电泳，拔与删年夜的量粒DNA，为年夜要的重组子。用限制性酶BaH战ER举止酶切断定，酶切收死了0.8Kb的片段，与预期契开图4。证实为所需的重组子，命名1讲:经Hind酶切的DNA标准;2讲:无;3讲:pPI3.5K-HNL/BaH+ER;4讲:pPI3.5K-HNL/BaH图4酶切断定重组子pPI3.5K-HNL为pPI3.5K-HNL，其构建流程睹图5。图5重组量粒pPI3.5K-HNL的构建流程已有的研讨结果说明，木薯基果组中露有多个HNL基果成员，已肯定

8、序列的有最少3个成员，包露ehnl10,ehnl14,ehnl24和lnhnl年夜要为新成员。将本研讨获得的醇腈酶DNA与已报导的，同源性较下的序枚举止了序列比拟，结果表示与e-HNL10DNA序列的同源性为99.1%，氨基酸序列同源性为98.8%，与lnhnlDNA序列的同源性为98.8%，氨基酸序列同源性为98.1%。但根据同源性比拟结果，我们借没有能肯定本研讨中克隆的HNL属于其中的哪一类成员。甲醇酵母pihiapastris表达系统是一种较好的中源基果表达系统，它的卵黑量减工方法战下列图3克隆的木薯HNLDNA序列及揣测的氨基酸序列Fig.3Nuletideanddeduedainai

9、dsequenesf-hydrxynitrilelyaseDNAfrassava阴影局部表示:克隆到的木薯HNLDNA序列与e-HNL10DNA相比,碱基对没有同的局部;乌体局部表示：与lnhnlDNA相比,碱基对没有同的局部.圆框局部表示:根据克隆的木薯HNLDNA序列所揣测的其氨基酸序列与e-HNL10相比没有同的局部;下划线表示:与lnhnl相比没有同的局部。Shad:thedifferentpartfbasepairsparedte-HNL10DNA;Blak:thedifferentpartfbasepairsparedtlnhnlDNA;Pane:thedifferentpartfdeduedainaidsequenesparedte-HNL10;Underline:thedifferentpartfdeduedainaidsequenesparedtlnhnl.等真核死物类似，为理想的下档真核卵黑表达系统9。如今国中从多莳动物中克隆了HNL基果,其中Hasslaher等将去自三叶胶的HNLDNA分别正在年夜肠杆菌、酿酒酵母战甲醇酵母中真现了表达，研讨结果说明三叶胶HNLDNA正在甲醇酵母中表达量最下，目的产品可达可溶性总卵黑的30%10；而Haughes等正在年夜肠杆菌中表达了去自