临床免疫学检验：免疫金标记技术

1、1免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 2目的和要求掌握金免疫测定在临床快速检验中的应用斑点免疫金渗滤试验和金免疫层析试验的原理及方法学评价熟悉胶体金与免疫金的特性、制备过程和影响因素了解金免疫组织化学技术3免疫技术试剂标本AgAbAbAg4标记免疫技术试剂标本Ag*AbAb*Ag放射性核素荧光素酶化学发光剂胶体金标记物技术放射性核素放射免疫技术荧光素荧光免疫技术酶酶免疫技术化学发光剂化学发光免疫技术胶体金金免疫技术5金免疫测定技术 金免疫组织化学染色技术 金免疫技术斑点金免疫渗滤试验金免疫层析试验金免疫光镜染色技术金免疫电镜染色技术6简介 胶体金颗粒具

2、有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒； 当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现肉眼可见红色或粉红色斑点(线); 从而用于抗原或抗体物质的定位或定性。金免疫组织化学染色技术金免疫测定技术78制备胶体金制备免疫金建立金免疫测定技术9胶体金的特性胶体金（金溶胶）：是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。胶体金的特性胶体性质：稳定性、对电解质的敏感性光吸收性和呈色性：胶体金的光吸收峰波长随颗粒的大小而变化。稳定性：影响因素-电解质、溶胶浓度、温度、稳定剂10呈色性不同大小的胶体金呈现不同的颜色 小颗粒-橙黄色 中等颗粒酒红色 较大颗粒深红色 大颗粒

3、紫色 11胶体性质稳定性：稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮于液体中121柠檬酸三钠加入量（ml）*胶体金特性 max 呈色162.00 橙色518nm24.51.50 橙红522nm411.00 红色525nm71.50.70 紫色535nm胶体金粒径（nm）13胶体金的制备化学还原法:向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子,形成金颗粒悬液。还原材料：氯金酸（HAuCl4)还原剂：枸橼酸盐、白磷、硼氢化钠、维生素C。最常用的制备方法：枸橼酸盐还原法 14 操作要点 配HAuC4水溶液 加热 沸 枸橼酸三钠 搅动 加热 沸（约23min*）冷却 加蒸馏水至 原体积 * 见淡黄

4、色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后 很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定 成红色。通过改变枸橼酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒15制备胶体金的注意事项（1）玻璃容器必须是 最好是经硅 化处理的。（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性（3）氯金酸易潮解（4）制备胶体金应用 或者是 高质量的去离子水。 ，不应使用金属药匙称量氯金酸。双蒸/三蒸馏水，绝对清洁的，应干燥、避光保存。16胶体金的鉴定和保存鉴定 1、 清亮透明 2、金颗粒的大小 通过观察胶体金的颜色，粗略估计金颗粒的大小； 分光光度计扫描max来估计金颗粒的粒径 电镜观察保存 保存于洁净的玻璃器皿中，室温或4C，加入少许防腐剂（如0.02N

5、aN3）可有利于保存。17优 质劣 质18免疫金的特性用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。物理吸附性： - - - + + + + 胶体金蛋白质19免疫金的制备制备要点PH值的调整：原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱 蛋白质最适标记量的确定标记过程离心纯化：超速离心法 免疫金最终用稀释液配成工作浓度保存 ：稳定剂-PEG，BSA20待标记蛋白作系列稀释+定量胶体金+Nacl最适标记量：能

6、保持红色不变而蛋白含量最低的一管蛋白量逐渐减低对照管21金免疫测定技术 固相膜免疫测定技术固相载体：硝酸纤维素膜标志物：胶体金斑点金免疫渗滤试验（ dot immunogold filtration assay,DIGFA ），又称为滴金免疫测定法金免疫层析试验 （ goldimmunochromatographic assay,GICA ） 22斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay,DIGFA) 操作示意图装置分解图盖微孔膜吸水垫料底加标本 免疫金 洗涤液23技术类型：夹心法、间接法双抗体夹心法24间接法25质控双抗体夹心法：相应抗原间接法：反应

7、斑点质控点人IgG26反应线质控线阳性阴性DIGFA双抗体夹心法测抗原AB操作技术要点DIGFA结果判断29金免疫层析试验（goldimmunochromatographic assay, GICA)GTC30 夹心法 竞争法(抑制法） 间接法金免疫层析试验（ goldimmunochromatographic assay,GICA )双抗原夹心法双抗体夹心法31双抗体夹心法G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：特异性抗体 吸水纸标本阳性结果33竞争法标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT区：标准抗原 吸水纸阳性结果34标本G区：金标特异性抗体(兔型)C区：羊抗兔IgT

8、区：标准抗原 吸水纸阴性结果35间接法反流免疫层析法合上检测盒窗(B)吸水材料(A)金标抗人IgG(G0)吸水材料(D)吸水材料(F)标本加样区(E)包被抗原（T）标记线(G)液体流动方向包被抗抗体（C）36标本CTCT闭合前闭合后E阳性结果37CT38DIGFA与GICA的比较DIGFA （穿透滤过型）GICA （横向流动型）硝酸纤维素膜的种类圆片膜窄长型膜试剂形式渗滤装置及2瓶液体试剂（液相形式 ）单一试剂条(板)（固相形式 ）操作步骤31观察时间操作结束(约3min)即刻观察操作结束后等待3-20min39IFA 穿流（FLOW THROUGH）ICA 横流（LATERAL FLOW）4

9、0免疫金标记技术的优点结果判读简单：以胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记自带质控对照简便、快速：全部检测过程仅需 3-20分钟。可单份检测41免疫金标记技术的不足之处敏感度略低，价格略高（与ELISA比）一般作为定性，不易定量。 金标法在临床中的应用感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志心肌标志滥用药物实例1：HBsAg的检测实例2：HCG的检测42金免疫组织化学技术一、免疫金（银）光镜染色技术二、免疫金电镜染色技术43 免疫金银染色原理示意图44临床应用与评价检测细胞悬液或培养单层细胞的膜表面抗原检测培养的单层细胞胞内抗原检测组织中或切片中的抗原免疫金电镜染色技术：操作简便，

10、敏感性高，定位精确，双标记或多标记免疫金（银）光镜染色：敏感性提高，可以替代荧光免疫技术；弥补其它标记染色技术本底过高和内部酶活性干扰的缺点46HBsAg诊断试剂试剂盒参考图示 47操作步骤1：洗净双手 步骤2：用采血针采指尖血 步骤3：将1滴指尖血滴入加样孔 ，或者用吸管将1滴指尖血滴入加样孔48步骤4：立即加1-2滴缓冲液 步骤5：15分钟读取结果 49?结果 ?结果 50早孕胶体金法检测试剂 步骤:从包装铝箔袋中取出试纸条步骤:将试纸条按箭头方向插入尿液标本中步骤:至少5秒后取出放于干净平台上或放在尿杯中读结果。测试结果应在3分钟读取.51小结金免疫测定技术 金免疫组织化学染色技术 金免疫技术斑点金免