蛋白质分离纯化

1、蛋白质分离纯化第1页产物大多处于细胞内, 提取前需将细胞破碎, 增加了很多困难;产物浓度较低、杂质多, 而最终成品要求到达纯度高, 故提取较困难, 且收率低, 常需好几步操作并需采取高分辨力精制方法;产物都是大分子蛋白质, 通常不稳定, 遇热、极端pH、有机溶剂和剪切力等易引发失活。重组蛋白分离纯化过程特点第2页 1 蛋白质分离方法（1）以大小或质量为依据： 离心（300000g)、凝胶过滤（Sephadex交联葡聚糖、Bio-Gel交联聚丙烯酰胺）、透析、超出滤（2）以电荷为依据： 离子交换色谱（低离子强度、适当pH） DEAE- Sephadex、 CM- Sephadex、 DEAE-纤

2、维素、CM-纤维素；电泳（电荷、分子大小、分子形状）、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中平衡位置）第3页（3）以溶解度改变为依据：改变pH、改变离子强度、降低介电常数（4）以特异性结合位置为依据：亲和色谱、亲和洗提（5）其它方法：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性非离子聚合物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩第4页(1) 以大小或质量为依据1.1 离心1.2 凝胶过滤第5页 1.1 离心原理：以质量不一样为分离依据离心力:5000-50000g处理量可达几升分离对象:细胞碎片、沉淀下来酶第6页 高速离心 速度普通在20,000 g以下。 超离心 相

3、对离心力场速度在75,000 g以上，在80,000250,000 g 之间。利用物质密度不一样，经超速离心后，分布于不一样液层而分离。 1. 主要分离小分子量酶。 2. 超速离心也可用来测定蛋白质分子量，蛋白质分子量与其沉降系数S成正比。 第7页 凝胶层析基本原理： 是利用有一定孔径范围多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离层析技术，又称为分子筛分子直径比凝胶最大孔隙直径大，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻分子即使大小不一样，也不能分开；它们下行速度快分子直径比凝胶最小孔隙直径小，能进入凝胶颗粒全部孔隙即使大小不一样也不能分开；它们下行速度慢鉴于上述原理，凝胶

4、层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。 1.2 凝胶过滤第8页A. 原理：不一样大小分子进入颗粒状凝胶内微孔能力不一样，能进入微孔小分子被阻滞，不能进入微孔大分子未被阻滞(如图)。B. 换句话说，分离是因为不一样分子在进入或不进入凝胶所经过旅程不一样而到达分离目标。C. 其它名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻层析、 Sephadex(交联葡聚糖）、Bio-Gel(交联聚丙烯酰胺）D. 酶后期处理（小量试样）大分子小分子 凝胶颗粒凝胶排阻示意图解第9页大分子小分子 凝胶颗粒凝胶排阻示意图解VoVt-Vo=Vi+VmVt凝胶柱床中Vt 、Vo等关系示意图柱床体积空隙体积Vt: 总体

5、积Vo: 外水体积Vi: 内水体积Vm:凝胶基质体积第10页葡聚糖凝胶操作流程：1）选择 依据分子量大小范围选择凝胶。 凝胶 如:G50排阻1,500-30,000 （Sephadex） 还有粗，中，细分，细分辩率高,流速慢；粗分辩率低,流速快。2）溶涨 水浸或沸水煮，快而能够杀菌，预防微生物污染。3）装柱 不能有气泡，用缓冲液平衡4）上样 按柱床体积计算约1/ 40左右。 然后用缓冲液洗脱。注意流速。5）再生 稀盐和缓冲液洗涤，保留在液体中，为预防微 生物生长，加0.02% NaN3或20乙醇。 使用时要注意可能抑制你要分离酶。第11页(2)以电荷为依据2.1 离子交换色谱2.2 电泳2.3

6、 等电聚焦第12页 2.1 离子交换色谱取决于带相反电荷基团静电吸引。离子交换层析基本原理：是以离子交换剂为固定相，以特定含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对分离各种离子结协力差异，而将混合物中不一样离子进行分离层析技术。第13页1. 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一个不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，琼脂糖等；2. 离子交换剂中所含可解离基团在水溶液中能与溶液中其它阳离子或阴离子起交换作用离子交换剂基本性能3. 假如有两种以上成份被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时，各成份被洗脱可能性取决于各自反应平衡常数4. 吸附在离子交换剂上蛋白质可经过改变pH使吸附蛋白质失去电荷而解离

7、下来5. 不一样蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不一样，即亲和力大小有差异，所以只要选择适当洗脱条件便可将混合物中成份逐洗脱下来，到达分离纯化目标第14页 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型可电离基团磺酸基（-SO3H） SP离子交换剂分类 磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH） CM 酚羟基（-OH） 阳离子交换剂：强酸型和弱酸型 可电离基团伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3)2） DEAE 季胺基（-N+(CH3) 3 ） Q第15页离子交换介质基本性质离子交换剂分类强离子交换剂电离率基本不受pH值影响，离子交换作用pH范围宽弱离子交换剂电离率受pH影响很

8、大，离子交换作用pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐步降低，离子交换能力逐步减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐步降低，离子交换能力逐步减弱第16页1）离子交换剂选择： 考虑酶稳定性需要 酶蛋白在pIpH条件下稳定 用阳离子交换剂。 酶蛋白在pIpH条件下稳定 用阴离子交换剂 在pI pH,pI pH条件下稳定 二种交换剂都可用 2）怎样选择强型和弱型交换剂 酶蛋白pI在 9 时 考虑用强型离子交换剂 酶蛋白是强型或弱型离子 考虑到酶不稳定性， 交换剂通用，选弱型。离子交换介质选择标准第17页12346789105等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂蛋白质净电荷

9、pH pI（-）对pI=5某酸性蛋白质当蛋白质为阴离子时，在pH5.5-9.0范围内，应首选DEAE；当蛋白质为阳离子时，在pH3.5-4.5范围内，应首选CM.pH-+第18页样品进柱为了到达满意分离效果，进样量普通为小于介质交换容量50%为了防止进样溶液中离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换离子或功效基团总数离子交换层析基本操作第19页样品洗脱102030405060708090离子交换层析基本操作pH值分子浓度离子强度恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱第20页解吸方法：改变pH（改变结合基团电荷），提升溶液离子强度（与酶竞争结合位置）使用规模可大可小纯化倍数为10左右，控

10、制好条件能够更高第21页 2.2 电泳带电粒子在电场中移动现象称为电泳。原理：在外加电场影响下，带电分子含有不一样运动速度。不一样蛋白质分子所带电荷量不一样，且分子大小也不一样，故在电场中移动速度也不一样，据此可相互分离。蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质溶解度最小，在电场中不移动。支持介质：纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺。第22页2. 3 等电聚焦 依据：在pH梯度中平衡位置。 用两性电解质，多乙烯多胺与丙烯酸同系多异构体混合物。在电场作用下，形成连续平滑pH梯度，而酶样品在其中也形成相同等电点pH梯度。 分辩率高

11、，pI相差0.01 pH酶与蛋白质可分离 。 注意：在pI附近蛋白质轻易沉淀，影响分离数量和质量。第23页（3）以溶解度改变为依据 3.1 盐析-改变pH(等电点沉淀法) 3.2 盐析-改变离子强度 3.3 PEG沉淀法第24页 3.1 改变pH (等电点沉淀法) 调整pH至酶等电点。原理： 溶解度随分子引力加大而减小，其它条件相同，当pH在等电点附近时,分子引力最大，蛋白质就沉淀。 普通不单独使用，配合其它方法使用。 第25页 3.2 改变离子强度盐溶现象：加入离子有利于分散大分子上所带电荷而使溶解度提升。盐析：离子强度提升到超出某一数值，带电分子将会沉淀下来。第26页 1. 在蛋白质溶液中

12、加入大量中性盐，以破坏蛋白质胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。 2. 惯用中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 3. 盐析时，溶液pH在蛋白质等电点处效果最好。 4. 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引发蛋白质变性。 第27页特点： 1. 最古老, 但应用广 2. 惯用(NH4)2SO4，因为溶解度大 0时， (NH4)2SO4溶解706g/L; 25时，(NH4)2SO4溶解767g/L; 在 0时也能把几乎全部蛋白盐析出来。第28页操作方式： 惯用加饱和(NH4)2SO4溶液或加固体（NH4)2SO4 缺点：脱盐（对浓盐溶液透析），分辨率低。 优点：简便、安全、重复性高。第29页 半

13、饱和硫酸铵离心球蛋白沉淀血清血清离心饱和硫酸铵白蛋白沉淀分段盐析半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。第30页第31页4.1 亲和色谱4.2 亲和洗提（4）以特异性结合位置为依据第32页 亲和层析 原理：酶底物或竞争性抑制剂经过共价键与惰性载体（如琼脂糖）相连接，形成亲和载体。当混合物经过亲和载体时，酶因为与底物或竞争性抑制剂之间有非共价键特异性相互作用而保留在柱子上，其它酶和杂蛋白被洗出柱子。然后加入底物进行竞争，或改变pH或离子强度使结合酶解吸，从而到达分离目标。第33页亲和层析基本特点亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性亲和力进行分离一类特殊层析

14、技术，它有以下特点：纯化过程简单、快速，且分离效率高尤其适合用于分离纯化一些含量低、稳定性差生物大分子纯化倍数大，产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一配基及寻求稳定层析条件所以应用范围受到一定限制第34页含有特异性亲和作用生物分子抗原与抗体DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子激素或药品与其受体维生素与其特异性结合蛋白糖蛋白与其对应植物凝集素第35页亲和层析载体选择含有多孔立体网状结构，能使被亲和吸附大分子自由经过含有良好机械性能均匀珠状颗粒，含有良好流速含有惰性，尽可能降低非专一性吸附含有相当量易活化基团，在温和条件下能与配基共价合偶联在偶联、吸

15、附和洗脱时，有很好物理化学稳定性第36页惯用亲和层析载体纤维素葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体第37页亲和层析配基选择纯化对象和配基之间必须有较强亲和力但亲和力太高也是有害，因为在解离配基复合物时所需条件就要强烈，这么可能使生物分子变性配基必须含有适当化学基团，用于和载体相连，但这种基团不参加配基与生物分子之间特异结合，还不能影响配基与生物分子之间亲和力第38页非专一性洗脱通常采取改变pH、离子强度、离子种类或者温度等使固定配基与生物大分子结合亲和力降低，但使用较广泛是改变溶液离子强度。非专一性洗脱剂作用并不是使被吸附生物大分子构象发生改变，而是洗脱剂中某一组分与固定配基形成复合物，使固定化配基对对应生物大分子亲和力降低第39页 专一性洗脱 使用特异配基作为洗脱剂使用含有与亲和配基或目标产物含有亲和作用小分子化合物溶液为洗脱剂，经