乌司他丁对脓毒症大鼠肺微血管通透性及肺组织PEDF表达的影响

1、乌司他丁对脓毒症大鼠肺微血管通透性及肺组织PEDF表达的影响蔡施霞，邓烈华，佟琳，孙小聪【摘要】目的观察乌司他丁注射液对脓毒症大鼠肺微血管通透性及肺组织色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响，探讨乌司他丁对脓毒症大鼠肺保护的作用机制。方法30只健康的雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组(A组)、阳性对照组(B组)、乌司他丁治疗组(组)，每组10例。除假手术组外，其他组均施行盲肠结扎穿孔术(LP)复制大鼠脓毒症模型，治疗组同时给予乌司他丁腹腔注射(100ku/kg)，术后4h随机处死大鼠5只取组织标本，剩余5只大鼠经颈外静脉注射伊文思蓝观察肺微血管通透性。分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PR)法

2、和酶联免疫吸附(ELISA)法检测肺组织中PEDF的表达。结果B组肺微血管通透性明显高于A、组，组肺微血管通透性高于A组;B组肺组织PEDF表达水平明显低于A、组，组肺组织PEDF表达水平低于A组(P0.05)。结论乌司他丁能明显抑制脓毒症大鼠肺微血管通透性增高，这种肺保护作用的机制可能与增加PEDF表达有关。【关键词】乌司他丁注射液;脓毒症;肺微血管通透性;PEDF【Abstrat】bjetiveTbservethepereabilityfpulnaryirvasularandexpressinfPigentepitheliu-derivedfatrinseptiratstreatedith

3、Ulinastatininjetin,andtinvestigatetheatinehanisfUlinastatinininpulnaryfuntinprtet.ethdsAttalf30healthyaleSDratsererandlydividedintthreegrups,andeahgruphas10rats,GrupAreEivedshaperatinandthethersunderentealligatinandpunture(LP)peratin.Alltheratsereaeptedintraperitnealinjetinfnralsaline(grupA,B)rUlina

4、statin(100ku/kg).Afterfurhurs,LungtissueexpressfPEDFinallratseredetetedbyreversetransriptin-plyerasehainreatin(RT-PR)andEnzye-linkediunsrbentassay(ELISA)ethdsrespetivelyandthepereabilityfpulnaryvasularerebservedbyinjetingEvansBlueintjugularveinfrats.ResultsThepereabilityfpulnaryirvasularingrupBeresi

5、gnifiantlyhigherthangrupAand,hihingruperehigherthangrupA.TheexpressinlevelsfPEDFingrupBeresignifiantlylerthangrupAand,hihingruperelerthangrupA.nlusinsUlinastatinisareliableprtetinagentfrseptiindueautelunginjury,anditsehanisfatinaybeinvlvedintheinreasefPEDFexpressin.【Keyrds】Ulinastatininjetin;Sepsis;

6、Pulnaryirvasular;PEDF脓毒症(sepsis)是合并感染的全身性炎症反应综合征(systeiinflaatinrespnsesyndre,SIRS)，进一步发展可导致多器官功能障碍综合征(DS),其中呼吸功能障碍发生率较高,出现时间早,其主要的病理生理改变为肺毛细血管通透性增加。而色素上皮衍生因子(PEDF)可使血管通透性降低，虽然临床研究证实乌司他丁有明确的肺保护作用，但其作用机制仍有待研究，本研究采用盲肠结扎穿孔术(LP)复制大鼠脓毒症模型观察乌司他丁对脓毒症大鼠肺微血管通透性和PEDF影响，探讨乌司他丁对脓毒症大鼠肺微血管通透性影响及其作用机制。1材料与方法1.1动物实

7、验分组SPF级SD雄性大鼠30只,体质量250300g(由广东医学院动物中心提供),按随机数字表法分为三组:假手术组(A组)，无菌状态下开腹寻找到盲肠后再将其还纳腹腔,然后逐层关腹,术后立即腹腔注射生理盐水(NS)2l;LP组(B组)，LP后立即腹腔注射NS2l;乌司他丁(UTI)治疗组(组),LP后立即腹腔注射UTI20ku/kg,加NS至2l。术后4h随机选取5只颈外静脉注射伊文思蓝液，剩余5只大鼠活杀取肺组织标本。为避免伊文思蓝影响肺组织PEDF表达测定，随机各取5只大鼠实验。1.2LP模型制备方法2动物在乙醚吸入麻醉下无菌开腹手术,在距盲肠末端1处用7号丝线结扎盲肠,用22G针头在被结

8、扎盲肠上对穿3次,注意避免粪便污染,并用生理盐水2l湿润肠管,按生理位置还纳肠管。术毕逐层关腹,并于腹壁皮下注射林格氏液50l/kg抗休克处理。术后自由进食水。1.3观察指标及标本处理观察大鼠术后活动、进食、竖毛、腹泻、眼球凹陷、呼吸以及活杀后腹腔肠管扩张、充血、腹水、病灶包裹、肝肿大、肺表面充血等情况。活杀取标本时大鼠在乙醚吸入麻醉下,开腹留取右叶肺缘组织100g,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后立即置液氮冻存,置-80冰箱待逆转录-聚合酶链反应(RT-PR)检测肺组织PEDFRNA表达。取右下肺组织200g,快速PBS漂洗两次后,置碾钵中用液氮制备肺组织匀浆,采用酶联免疫吸附ELISA法检测

9、肺组织PEDF蛋白表达。1.4检测肺组织PEDFRNA表达采用RT-PR技术检测。取肺组织100g置碾钵中用液氮制备肺组织匀浆,采用Trizl(Siga公司)一步法提取肺组织总RNA。采用两步法RT-PR试剂盒(Invitrgen公司)进行RT-PR,以GAPDH作为内参照,以10l扩增产物经质量分数115%琼脂糖凝胶电泳后,用Labrk410UVP成像系统照相并分析结果。以目的基因与内参照在凝胶上的灰度值比值为基因表达的相对含量。大鼠PEDF序列(扩增片段为374bp):上游5-ATGATGTAGATA-3,下游5-GGGGATAAAAAGGATG-3,PR反应条件:942in预变性,946

10、0s变性,5630s退火,7250s延伸,共计30个循环,727in延伸。RT-PR操作严格按照说明书进行。1.5检测肺组织PEDF蛋白表达采用ELISA法检测。严格按照大鼠血管内皮生长因子ELISA试剂盒(武汉中美科技有限公司)说明书操作，酶标仪(BI-RAD680)波长450n下读取吸光度，根据标准曲线得出PEDF浓度。1.6肺微血管通透性的测定(1)伊文思蓝含量测定法。按20g/kg经左侧颈外静脉注射2%伊文思蓝液(北京恒业中远化工有限公司)，30in后将动物麻醉开胸取部分左肺，剪去周围组织，吸干表面水分及血液，称量湿质量，将肺组织剪成约103小块浸泡于甲酰胺溶液中(0.2g/kg)，置

11、60恒温水浴中抽提24h，待组织中色素全部浸出，取出组织，离心，取上清液，在与标准曲线相同的条件下，用紫外分光光度计(岛津2000)在620n波长处进行比色测定光密度值，在标准曲线上查出EB含量，以每克肺组织干重含EB质量表示。(2)湿/干质量比测定:称肺组织湿质量后，置烤箱80，72h，称干质量，计算湿/干质量比值。1.7数据处理采用SASv8.1统计软件包对所得资料进行统计分析。计量资料采用SNK-q检验,P0.05为差异有显著性。2结果2.1大鼠一般情况观察B组大鼠术后2h活动度即明显下降,并逐渐表现出厌食、竖毛、眼球下陷、呼吸急促、对外界刺激反应淡漠等。腹腔肠系膜充血、肠管显著扩张、被

12、结扎盲肠坏死、血性腹水、病灶处大网膜包裹不佳、肝肿大、肺充血明显。组亦有厌食、竖毛、活动度减少等情况,但明显较B组轻微,且组肠管仅轻度扩张,腹水减少,坏死盲肠被大网膜及周围肠管包裹明显。A组没有相关表现。2.2大鼠肺组织PEDFRNA表达B组明显低于A、组，组低于A组(P0.05)，见表1。2.3大鼠肺组织PEDF蛋白表达B组明显低于A、组，组低于A组(P0.05)，见表1。2.4肺组织EB含量B组明显高于A、组，组高于A组(P0.05)，见表1。2.5肺组织湿/干质量比B组明显高于A、组，组高于A组(P0.05)，见表1。表1各组大鼠实验测定值注：*P0.05paredithgrupA，#P

13、0.05paredithgrupB3讨论脓毒症主要表现为系统炎症和器官功能损害，而微血管通透性增高是器官功能受损的重要特征之一。血管通透性增高，一方面使大量液体渗入组织间隙，增加毛细血管与细胞间的距离，加重组织细胞的缺氧;另一方面还使炎症细胞过多聚集于局部组织，通过释放蛋白酶及氧自由基等，直接造成组织细胞的损伤1。国外学者的研究显示,组织的缺血缺氧可使组织血管内皮生长因子(VEGF)表达增强2。VEGF是一种特异地作用于血管内皮细胞的生长因子，是目前已知的最强烈的血管渗透剂，低氧和VEGF能调节基质金属蛋白酶(atrixetallprtEinases,Ps)的活性,PEDF是Ps-2和Ps-9

14、的作用底物,这样,低氧和VEGF通过Ps的蛋白溶解作用使PEDF水平下调,VEGF/PEDF升高,病理变化随之发生3。PEDF能够阻止缺氧导致的转录产物VEGF-及其受体VEGF-R3的减少，VEGF-、VEGF-R3转录水平的稳定阻止低氧环境中血管的渗漏4，5。乌司他丁注射液是从人尿中提取的一种具有广谱蛋白酶抑制作用的糖蛋白，研究证实它可以有效抑制脓毒症向多器官功能障碍综合征(DS)转化，可有效降低脓毒症患者的死亡率6，国内外目前并未见有关乌司他丁对脓毒症血管通透性影响的报道。本研究通过向脓毒症大鼠颈外静脉内注射伊文思蓝测定肺组织对这种染料的通透性，证实乌司他丁可以阻止大鼠微血管通透性增高的

15、推测，进一步了解乌司他丁治疗脓毒症的作用机制。本研究发现外源性给予乌司他丁后，大鼠微血管通透性明显降低，同时亦检测到大鼠肺组织PEDF的表达较LP组明显升高。我们推测乌司他丁可能通过增加大鼠肺组织PEDF的表达降低大鼠微血管通透性，从而起到肺保护作用。这与国外相关研究7,8表明在脓毒症患者血清中色素上皮衍生因子(PEDF)显著降低，PEDF可使血管通透性降低是一致的。当然对于脓毒症发生及发展过程肺组织表达的动态变化以及乌司他丁作用的时间依赖性，还有待于我们进一步深入研究。【参考文献】1PedraA,Razandi,LevinER.Deipheringvasularendthelialellgr

16、thfatr/vasularpereabilityfatrsignalingtvasularpereability.Inhibitinbyatrialnatriuretipeptide.JBilhe,2002,277(46):44385-44398.2BekerP,AlasabasA,YuAY,etal.xygen-independentupregulatinfvasularendthelialgrthfatrandvasularbarrierdysfuntinduringventilatedpulnaryisheiainislatedferretlungs.AJRespirelllBil,2

17、000,22(3):272-279.3NtariL,illerA,artinezA,etal.Pigentepitheliuderivedfatrisasubstratefratrixetallprteinasetype2andtype9:ipliatinsfrdnregulatininhypxia.InvestphthallVislSi,2005,46:2736-2747.4YaagishiS,atsuiT,NakauraK,etal.Pigent-epitheliu-derivedfatr(PEDF)inhibitsangitensin-II-induedvasularendthelialgrthfatr(VEGF)expressininLT-3Tellsthrughanti-xidativeprperties.irvasRes,2006,71(3):222-226.5RenJG,Jie,Talbt.HPEDFpreventsangigenesis:ahypthesizedpathay.edHyptheses,2005,64(1):74-78.6尹勇,高乃荣,李兆丽.乌司他丁对急性坏