抗癫疒间药物诱导对血脑屏障上P糖蛋白功能与表达的影响

1、抗癫疒间药物诱导对血脑屏障上P-糖蛋白功能与表达的影响【摘要】目的研究长期使用抗癫疒间药物(AEDs)对大鼠脑中P-糖蛋白(P-gp)功能活性和表达程度的影响。方法选择苯巴比妥、苯妥英钠和卡马西平三个典型AEDs，在大鼠体内连续给药21天，然后观察脑组织中皮质和海马P-gp的改变。结果底物罗丹明123转运实验说明P-gp功能增强，进一步通过esternBlt分析说明P-gp表达增强，并用免疫组化染色显示其细胞定位在血脑屏障上。结论长期AEDs诱导可以同时导致大鼠血脑屏障上P-gp功能活性和表达程度的升高。【关键词】P-糖蛋白;血脑屏障;抗癫疒间药物;诱导Abstrat:bjetiveTinve

2、stigatehetherhrniexpsurefantiepileptidrugs(AEDs)inreasedP-glyprtEin(P-gp)funtinandexpressininbrainfrats.ethdsThreedrugsphenbarbital(PB),phenytin(PHT)andarbaazepine(BZ)ererallygiventratsfrsuessive21days,P-gpativityandlevelsinbrainasassessed.ResultsTissue-t-plasanentratinratisfRh123eresignifiantlydere

3、asedinerebralrtexandhippapus.Iunhistheistryresultshedthatup-regulatinftheP-gpainlyurredinapillaryendthelialvessels.esternbltresultsuggestedthattheprtEInlevelfP-gpinrtexandhippapusfratsexpsedtdrugsassignifiantlyhigherthanthatfntrlrats.nlusinhrniexpsurefAEDsayinreaseP-gpfuntinandlevelinbrainfrats.Keyr

4、ds:P-glyprtein;Bld-brainbarrier;Antiepileptidrugs;Indutin癫疒间是一种慢性神经性疾病，患者中约有30%为难治性癫疒间，严重影响患者的生活质量，成为一个医学难题。越来越多的研究证明，难治性癫疒间患者脑内外排转运体的表达上调，如P-糖蛋白(P-glyprtein，P-gp)、多药耐药相关蛋白(ultidrugresistaneprtein，RP)等1-2。血脑屏障主要由单层脑微血管内皮细胞构成，调节和保护大脑微环境。P-gp是血脑屏障上一种重要的外排转运蛋白，许多药物包括一些抗癫疒间药物(antiepileptidrugs，AEDs)都是它的

5、底物3-4。有研究发现AEDs诱导的脑微血管内皮细胞(brainirvasularendthelialells，BEs)中P-gp表达显著高于正常对照组，且呈剂量和时间依赖性5。因为BEs是构成血脑屏障(bld-brainbarrier，BBB)的主要形态学根底，那么为了证实AEDs是否也会对BBB上的P-gp产生诱导作用，且其是否是癫疒间患者长期用药后出现治疗失败的原因之一，本实验讨论长期使用AEDs是否可以诱导大鼠脑中P-gp功能活性和表达程度的上调。1材料和方法1.1药品与试剂罗丹明123标准品(rhdaine123，Rh123)购自美国Siga公司;甲醇为色谱纯(美国FisherIn.

6、);苯巴比妥(phenbarbital，PB)购自上海新亚药业;苯妥英钠(phenytinsdiu，PHT)购自天津力生制药股份;卡马西平(arbaazepine，BZ)购自上海三维制药;鼠anti-P-gp一抗(219，IgG)购自美国albihefEDBisienesIn.;IRDyeT800抗鼠IgG二抗购自美国RklandIn.;鼠anti-atin单克隆抗体购自中国BsterBiteh公司;其余试剂均为市售分析纯。1.2仪器L-10ADVP高效液相色谱仪，RF-10AXL荧光检测器(日本Shiadzu);5810R台式高速冷冻离心机(德国Eppendrf);61型电泳仪(北京六一仪器

7、厂);半干转膜仪(北京六一仪器厂);6131型核酸、蛋白质含量测定仪(德国EppendrfIn.)。1.3动物与分组安康雄性Sprague-Daley大鼠，体重180200g，由中国药科大学实验动物中心提供，合格证号：SXK(苏)2002-0011。动物实验由中国药科大学动物伦理委员会批准施行。动物随机分组，每组6只，苯巴比妥组给予苯巴比妥15g/kg，苯妥英钠组给予苯妥英钠25g/kg，卡马西平组给予卡马西平50g/kg，正常对照组给予等体积的羧甲基纤维素钠，给药体积为1l/100g。每天灌胃给药2次，连续给药21天。1.4方法1.4.1P-gp功能分析给药周期完毕后，AEDs诱导组大鼠与正

8、常对照组大鼠静脉注射Rh1230.2g/kg(临用前以生理盐水配制成0.1g/L，给药体积为2l/kg)，60in后股动脉取血(约3l)于肝素化试管中，立即断头处死大鼠，剥取脑皮质与海马。血液离心(4000r/in，5in)后取上层血浆，采用甲醇沉淀蛋白，通过HPL-FLD进展血浆、脑皮质与海马中Rh123浓度测定，详细条件如下：流动相为乙腈-水相(1乙酸，2三乙胺)=4060，流速1l/in，检测波长：Ex485n，E546n，以脑皮质/血浆、海马/血浆的浓度比值进展统计分析。1.4.2免疫组织化学染色给药周期完毕后，AEDs诱导组大鼠与正常对照组大鼠用乙醚麻醉后立即断头处死，剥取脑皮质与海

9、马。相对于前囟点-0.8、-3.8分别取含皮质、海马构造的23厚脑块(冠状切面)，置福尔马林溶液中梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片。石蜡切片常规脱蜡和水化后，加50l过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10in，PBS冲洗3in3次;加50l正常非免疫动物血清，室温下孵育10in;加100l一抗(1100稀释)，37孵育60in;加50l二抗(1100稀释)，室温下孵育10in，PBS冲洗3in3次;加50l链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10in，PBS冲洗5in3次;DAB显色，脱水，透明，封片。切片在lypus-Vanx显微镜下观察并照相，照片导入IagePr-Plus显

10、微图像分析系统进展数据分析，选定阳性细胞后获得光密度(D值)表示P-gp免疫反响强度。1.4.3蛋白印迹检测P-gp表达定量称取大鼠脑皮质、海马，参加haps裂解液冰浴裂解1h，离心取上清液;膜蛋白液经核酸定量仪测定后100、5in变性;参加4ladingbuffer上样，100V电泳2.5h;转膜，10%脱脂奶粉37封闭1h;PBST清洗10in3次，参加一抗219(1200)37孵育1h，4过夜;PBST清洗10in3次，参加二抗(15000)37孵育1h;PBST清洗10in3次，显影。1.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件进展处理，各组数据均以s表示。各组数据总体差异的比拟采用单

11、因素方差分析(ne-ayANVA)，组间两两比拟采用q检验，P0.05为差异有显著性。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1P-gp功能的变化本实验使用经典的P-gp底物Rh123对P-gp的功能活性进展分析，结果见表1。21天的AEDs给药导致Rh123在脑皮质和海马中的浓度降低，而血浆中的浓度未见明显变化，使得Rh123脑皮质/血浆浓度比、海马/血浆浓度比显著降低。BZ、PHT、PB组脑皮质/血浆浓度比拟正常对照组显著下降(P0.05或P0.01)，PHT、PB组海马/血浆浓度比拟正常对照组显著下降(P0.01)，而BZ组无明显差异(P0.05)。表1Rh123在脑皮质和海马中分布的变化：脑皮

12、质;H：海马;P：血浆;与正常对照组比拟：*P0.05，*P0.012.2免疫定位与反响强度的变化P-gp抗体219的免疫定位主要位于组成血脑屏障的毛细血管内皮细胞顶膜上，阳性细胞被染成棕黄色。通过进一步半定量分析免疫反响强度(D值)发现，长期BZ、PB和PHT诱导的大鼠，脑皮质的D值均高于正常对照组大鼠，但无显著性差异，按D值大小排列：PB组BZ组PHT组正常对照组;海马的D值均高于正常对照组大鼠，且均具有显著性差异(P0.05)，按D值大小排列：PHT组BZ组PB组正常对照组(同一张切片，在高倍镜下任取3个观察视野，获得的D值取平均值作为一个动物的数据)。见图1。2.3P-gp表达的变化e

13、sternBlt分析显示，P-gp在AEDs诱导大鼠脑皮质中有较高表达，与正常对照组大鼠比拟，BZ、PHT、PB组表达的增加具有显著统计学差异(P0.01);P-gp在AEDs诱导大鼠海马中也有较高表达，表现与脑皮质中相似的变化趋势，与正常对照组大鼠比拟，BZ、PHT、PB组表达的增加具有显著统计学差异(P0.01)。见图2。3讨论本实验结果说明，AEDs长期诱导过程可能有促使大鼠不同脑区上P-gp表达上调的作用;而在P-gp功能活性分析中，AEDs诱导可以显著降低大鼠Rh123脑皮质/血浆比、海马/血浆比，说明AEDs诱导可能同时引起P-gp表达和活性的增强。在这些AEDs中，PHT显示最强的P-gp诱导作用，包括P-gp表达程度的诱导和P-gp功能活性的诱导。BZ诱导大鼠海马的P-gp表达和功能的变化之间存在一定的差异，BZ诱导大鼠的海马表现出比正常对照组大鼠更高的P-gp表达程度和免疫反响强度，但P-gp的功能活性与正常对照组大鼠相似。这一现象在其他文献中也有报道，en等6的实验称BZ可能不是P-gp的底物，不影响Rh123的外排;但BZ却可以在外周血淋巴细胞中诱导P-gp的表达7，此现象的内在机制在文献中仍不明