乙醛脱氢酶2对肥胖大鼠心肌的影响

1、 乙醛脱氢酶2对肥胖大鼠心肌的影响 于晓涵Summary：随着国民生活水平的提高，高脂饮食伴随的生活习惯逐渐成为大众主流。研究发现乙醛脱氢酶2（ALDH2）是一种在心肌保护方面具有重要作用的醛类氧化酶，能够改善心肌损伤和动脉粥样硬化等。因此，该实验通过高脂饮食构建肥胖大鼠模型，探讨ALDH2和心肌保护间的关系。Key：高脂饮食;心肌;乙醛脱氢酶21 前言社会的不断进步和发展，带动了国民的物质水平不断提高。中国居民的膳食习惯正在向以高脂饮食为主的西方膳食模式转变，特别是在大城市，这种现象更为显著。伴随着人们膳食金字塔的改变，一系列慢性病的发病率不断攀升，尤其是长期进食高脂食物可以增加冠心病的发病

2、率。流行病学资料显示，中国城市居民冠心病死亡率高达88.71/10万，以每年20%的速度增长。并且出现地区和性别差异，城市高于农村，男性高于女性，在发达的沿海城市这种情况更为显著1。冠状动脉粥样硬化性心脏病是由冠状动脉血管变窄或被阻塞使得心肌缺氧或梗死而引起的心脏病，简称冠心病，又被称为缺血性心脏病。过量摄入高脂食物后，会造成胆固醇和甘油三脂长期处于高水平状态，容易使动脉发生粥样硬化，引发心脏内的血液供给不足，致使心肌受损，最终引发冠心病。由于高脂食物中含有较多的饱和脂肪酸，经科学证实摄入饱和脂肪酸的量越多，冠心病的患病率就越大，二者呈正相关。冠心病已经影响到人类的生活质量，成为影响身体健康的

3、首要危险因素。因此如何降低高脂饮食模式对冠心病的发病率是目前亟待解决的重要问题。乙醛脱氢酶（ALDH）是醛脱氢酶中的一种，包含19个成员，每个成员由不同的染色体上基因编码。ALDH一共包括三类，存在于线粒体上的乙醛脱氢酶2（ALDH2）是其中的第二类。ALDH2是一种重要的醛类氧化酶，具有脱氢酶和酯酶的功能，能够催化乙醇的代谢产生乙醛并将其氧化为醋酸，然后将乙醛衍生物4-羟壬烯醛（4-HNE）氧化分解，生成无毒的酸，减轻活性氧和醛类氧化酶生成对细胞造成的损伤2。研究表明，ALDH2是不仅是酒精代谢的关键酶，还可以保護由氧化应激造成的细胞损伤。另有研究表明，在缺血再灌注损伤中，随着ALDH2活性

4、的提高，心梗出现的面积就越小，呈现反关系，证实ALDH2具有改善心脏功能，保护心肌的重要作用。目前关于冠心病与ALDH2的基因多态性之间的关系有很多研究。从它的生物学特性来看，ALDH2基因的12 号外显子的鸟嘌呤突变为腺嘌呤时，此时谷氨酸被替换为赖氨酸，根据该突变，ALDH2基因型在人群中就形成了3种组合方式：GG型（野生纯合子）、GA型（杂合子）和AA型（突变纯合子）。国内外在这两者的关系上有大量研究，有研究者选取了89名心梗患者和142名不稳定型心绞痛患，把231名患者分为ALDH2*1/ALDH2*1型（n=145）和ALDH2*1/ALDH2*2，ALDH2*2/ALDH2*2型（n

5、=86）两组，结果发现突变型患者心梗发病率高于野生型患者。日本的一项研究显示，ALDH2突变基因型成为了日本男性心梗的危险因素之一。但是进一步研究显示，ALDH2的突变型基因只是心梗发生的主要危险因素，与冠状动脉损伤的严重等级没有关联。研究提示，存在ALDH2*2等位基因的人患冠心病的风险更高，并且携带ALDH2*2的基因是心肌梗死和急性冠脉综合症中的主要危险因子，可能与ALDH2 活性降低后导致体内脂质积累、蛋白质合成受阻、活性氧增加等因素有关，不过具体的机制尚未明确。在既往的研究中显示，ALDH2活性的提高可以减慢动脉粥样硬化的进展，减轻乙醇对肝脏的损伤，减弱氧化应激反应的发生，对酒精中毒

6、可以起到解毒和治疗的作用。总结以上探究，ALDH2与心血管疾病密切相关，如冠心病，缺血再灌注损伤等。所以研究ALDH2在心血管疾病治疗方面的作用具有很重要的临床价值。本实验拟通过高脂饮食构建肥胖大鼠模型，同时结合血清中总胆固醇（TC）和肌酸激酶（CK）的变化，探讨ALDH2和心肌保护间的关系，为临床降脂和心肌保护提供一定的实验数据。2 材料与方法2.1材料2.1.1 实验动物清洁级SD大鼠雄性24只，2月龄，体重约290g。购于湖北实验动物研究中心。所有大鼠均自由进食，室温 214摄氏度下饲养。2.1.2仪器和试剂其林贝尔脱色摇床;垂直电泳槽1.5MM标配;VE-180转移电泳槽;高压电泳仪电

7、源;多功能酶标仪;超级恒温水浴锅;小型冷冻高速离心机;电磁搅拌器;上海勤翔超敏荧光及化学反应仪;超声波细胞粉碎机;优普超纯水制造系统;制冰机。由武汉万知生物有限公司提供BCA蛋白质浓度测定试剂盒;南京建成生物有限公司提供总胆固醇和肌酸激酶试剂测试盒。2.1.3 取材在干预后用戊巴比妥钠麻醉后，取心肌组织于-80冰箱中冷冻。通过眼球取血5ml静置30min后放于4冷柜过夜，隔天用1000转/分钟*10分钟的模式进行离心，离心后取上层血清保存于-20的低温环境中。2.2方法2.2.1高脂乳剂的配制取500ml规格的烧杯，将20g猪油放在烧杯中用磁力搅拌器加热到100后，加入2g胆固醇，用玻璃棒不断

8、搅拌使其熔化，再加入2g胆酸钠搅拌使其溶解。再取一个500ml规格的烧杯，把20ml吐温-80和20ml丙二醇倒入烧杯中用磁力搅拌器加热至60，然后加入1g丙硫氧嘧啶。等到丙硫氧嘧啶充分溶解后，将两个烧杯中的液体混匀。2.2.2实验分组适应性饲养一周后的大鼠随机抽取8只作为普食对照组（ND）提供标准饲料，另外16只给予高脂乳剂。并再将其随机分为两组，即高脂对照组（持续灌高脂乳剂，HR）、饮食限制组（DR，前四周喂食高脂乳剂，后四周喂食标准饲料）。八周后进行取材。2.2.3 总胆固醇指标检测南京建成公司试剂盒提供的酶标仪测试方法：在空白孔，标准孔和校准孔中分别加入2.5微升的双蒸水，标准品和样本

9、;接着将所有孔中加入250微升的工作液;混匀96孔板中各孔的液体;37孵育10分钟;用酶标仪设置510nm的参数;依据公式计算吸光度。2.2.4 肌酸激酶活力测试南京建成公司试剂盒提供的酶标仪测试方法：测定管中加入20微升的待测样本;接着将300微升的混合试剂分别加入测定管和对照管中;振荡混匀，37摄氏度，水浴20分钟。水浴之后，在对照管中加入20微升的待测样本，接着把试剂六分别加入两种管里，振荡混匀，每分钟500转，转10分钟，取上清加入定磷剂。混匀两个管中的液体，浴调至45加热15分钟。双蒸水调零设定参数660nm，测各管的吸光度。2.2.5 Western blot法测定ALDH2蛋白表

10、达提取心肌组织中的总蛋白：称取大鼠心肌组织，将其剪成小块;加入蛋白酶抑制剂液和蛋白裂解液2ml，充分研磨;用超声将细胞裂解后离心10分钟，离心后用取上清;加入Loading Buffer后煮样5分钟;BCA法测定蛋白浓度。配制SDS凝胶：配制前将两块玻璃板安装完毕，将配好得分离胶试剂（去离子水，2-丙烯酰胺，Tris-Hcl 8.8PH，SDS，过硫酸铵AP，TEMED）快速混匀，抓紧注入玻璃板间隙，直至玻璃板2/3高度，蒸馏水封胶，静置半小时后，倒掉水;接着把浓缩胶混合液（去离子水，2-丙烯酰胺，Tris-Hcl 6.8PH，SDS，过硫酸铵AP，TEMED）注入玻璃板间隙中直至小玻璃板位置

11、;插入梳子，静置1小时后上样。电泳：85v电压下跑胶。转膜：撬开两块玻璃，去掉上层浓缩胶，只留分离胶，将分离胶放入转膜液中;在转膜夹上按顺序放上海绵2层，滤纸3层，SDS凝胶，NC膜，滤纸3层，将其移入含有转膜液的转膜槽中;接通电源，350mA恒流跑90分钟。封闭：将NC膜取出放入封闭液中，摇床封闭1小时，封闭结束后在TBST液中清洗25分钟。孵育一抗：将NC膜按照所需的目的蛋白的分子量进行裁剪;剪好的条带放入到用5%BSA稀释过的一抗中，放入冰柜中低温摇床过夜。孵育二抗：取出抗体中的条带，在TBST液中漂洗3遍，每遍15分钟;接着放入稀释后的二抗中，室温下摇床孵育2小时;孵育结束之后，重复上

12、面步骤。曝光：按照A：B=1：1提前配制好ECL发光剂，避光保存;将条带放进超敏化学反应仪中，加上发光剂，进行曝光。2.3统计学分析实验数据以均值标准差表示，进行单因素方差分析;各指标间相关采用Person相关分析。统计分析用GraphPad Prism 5和SPSS 20.0软件处理，P0.05认为具有统计学意义。3 结果3.1 血清总胆固醇（TC）指标与普食对照组相比，高脂对照组的TC值显著升高（P0.05），并且超过正常范围的参考值;与饮食限制组相比，高脂对照组的TC值显著升高（P0.05）。3.2血清肌酸激酶（CK）活性测试高脂对照组和饮食限制组的CK值较普食对照组显著升高，差异具有统

13、计学意义（P0.05）。3.3 Western blot检测ALDH2的蛋白表达高脂对照组ALDH2表达较普食对照组显著降低，且差异具有统计学意义（P0.05）;高脂对照组ALDH2表达较饮食限制组明显降低，差异具有显著性（P0.05）。3.4指标间相关分析TC和CK指标之间具有相关性（P0.05）;TC和ALDH2指标之间具有相关性（P0.05）;CK和ALDH2指标之间具有相关性（P1.5。限制富含胆固醇多的食物，可以多吃洋葱，大蒜，香菇之类的可以降低胆固醇的食物。以谷物为主;多吃新鲜的瓜果蔬菜，保证各类营养物质的均衡摄取。清淡饮食，少盐少油。限制饮酒量，研究显示适量饮酒可以提高ALDH2的活性，保护心脏，过度的饮酒则会增加高血压，心力衰竭，脑猝死的风险。同时，积极参加体育运动，已有研究证实，运动可以预防心血管疾病的发生并改善疾病程度。本研究通过总胆固醇和肌酸激酶两个指标判断心血管疾病的风险，仍需要结合病理形态学观察。证实高脂饮食的摄入使得心肌乙醛脱氢酶2表达下降，但是具体的调控其蛋白表达的分子信号通路不清楚。5 结论八周高脂饮食可引起大鼠血清中总胆固醇和肌酸激酶的水平升高，心肌ALDH2蛋白表达下降，提示心血管疾病风险增加。尽早调整饮食结构，减少高脂食物的摄入，可以降低血清总胆固醇水平，增加心肌ALDH2蛋白表达，从而降低心血管疾病风险。Re