发酵知识课件

1、发酵知识熊涤生 2013年5月6日发酵的应用1.在医药工业上：胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物。2.在食品工业上：含醇饮料、乳制品、调味品、添加剂等。3.在化学工业上：氨基酸、香料、生物高分子、酶、维生素和单细胞蛋白等。4.在农业上：生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂，食用菌及药用真菌等。5.在环保方面：废弃物的处理、环境净化等。发酵工程： 是指采用工程技术手段，利用生物（主要是微生物）和有活性的离体酶的某些功能，为人类生产有用的生物产品，或直接用微生物参与控制某些工业生产过程的一种技术。注：现在广义的发酵工程已包括了动物和植物细胞工程技术发酵： 复杂的有机化合物在

2、微生物的作用下分解成比较简单的物质。发酵工程： 是用来解决按发酵工艺进行工业化生产的工程学问题的学科。可分为上游、中游和下游工程三个阶段。并且这三个阶段都有各自的工程学问题。上游工程：包括优良菌株的选育（筛选、分离、改造、纯化、鉴定），实验室阶段的条件优化（如培养基配比、培养T、pH等），菌种保藏、复壮。中游工程：也是狭义的发酵，指最适发酵条件下，在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术：包括对原料和设施的灭菌技术（方法、时间、温度）、空气过滤技术（材质、孔径）、计算机控制技术（参数检测、电磁阀开关控制、生产过程中相关数据的记录等）、工艺放大技术（培养基成分替代变更、接种时间及数量的调整

3、、诱导物添加数量及诱导时间的确定等）。下游工程：指从发酵液中分离和纯化产品的技术：包括固液分离技术（离心分离，过滤分离，沉淀分离等工艺），细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等），蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等），产品的包装处理技术（真空干燥和冰冻干事燥等），和废物（废水、废气、废渣）处理技术。发酵下游工程发酵中游工程发酵上游工程工业发酵分类对氧需要或不需要培养基是液态或固态发酵是在培养基表面或深层发酵是间歇或连续的菌种是否被固定在载体上菌种是单一还是混合菌种好氧发酵厌氧发酵液态发酵固态发酵表面发酵深层发酵分批发酵连续发酵游离发酵固定化发酵单一纯种发酵混合发酵

4、影响发酵过程的因素菌种无菌操作培养基设备过程控制发酵罐的基本条件（1） 发酵罐应具有适宜的径高比。罐身越高，氧的利用率越高。（2） 发酵罐能承受一定的压力。（3）要保证发酵液必须的溶解氧。（4）发酵罐应具有足够的冷却面积。（5） 发酵罐内应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底，避免染菌。（6） 搅拌器的轴封应严密，减少泄漏。四种好氧发酵罐比较机械搅拌通风发酵罐塔式发酵罐气升式发酵罐自吸式发酵罐机械搅拌通风式：直接通无菌空气自吸式：利用搅拌旋转时产生的抽吸力吸入空气。它的搅拌器是一个空心叶轮，叶轮快速旋转时液体由于离心作用而被甩出，并在叶轮空心部分形成负压，从而将罐外的空气吸到罐内。气升式：借

5、助在环流管底部的喷嘴将空气以250-300/s的高速喷入环流管，使气泡分散在培养基中。由于环流管内部的液体溶有大量气泡，其密度明显小于反应器主体中培养液的密度。塔式：利用通入培养液的无菌空气泡上升来带动液体运动，产生混合效果的非机械搅拌式发酵罐。四种发酵罐补气方式的不同机械搅拌通风发酵罐大小：20 L50000 L结构：主要由罐体、控温部分、搅拌部分、通气部分、进出料口、测量系统和附属系统等组成。 罐体：承受的压力至少在0.3MPa以上。 控温部分：包括测温的温度传感器及控温的夹套或盘管。一般容积小于50000L的发酵罐采用外夹套作为传热装置，容积大于50000L的发酵罐则采用立式蛇管作为传热

6、装置。 通气部分: 是从罐的底部向罐内通入无菌空气，一般入口处的压力为0.1-0.2MPa ，罐顶部有空气出口。 搅拌部分: 是由安装在一根轴上的多个涡轮式搅拌浆组成的。它具备许多功能：使罐内物料混合良好，便于营养吸收；可打碎气泡，加强氧的传递效果；与挡板结合，消除中心漩涡；产生高剪切速度，有利于物料混合均匀。 注：挡板和罐壁之间应有一定的空隙，以免出现死角并积垢。 进出料口：是进料和出料的装置，同时还配有补料口装置。 测量系统：包括温度、酸度和溶解氧的数据监控、传感器和测量装置发酵工艺流程准备消毒灭菌接种培养补料放罐与清洗检查与维护1.1 检查使用条件 定期检查公用工程配置与使用环境，使用前

7、检查各管道和导线接插件的连接是否正确，有无松动、老化或断裂。1.2 检查发酵罐密封件密封情况 检查罐盖和罐体法兰间及罐盖上各接插口的橡胶垫圈是否完好与妥善放置，均匀拧紧罐盖锁紧螺栓与插口压帽，关闭所有阀门；通入空气，检查有无漏气。1.3 试运转 打开接种口盖，向罐内注入水，盖上并旋紧接种口盖；夹套中通入冷却水，充满水后关闭冷却开关；罐体中通入空气，使罐压保持在0.12MPa；逐一检查水泵、加热器、搅拌电机、蠕动泵、电磁阀、照明灯等是否正常；校验pH和溶氧电极，设置温度、转速、pH、补料、消泡等参数，观察每个参数的测量与控制是否正确；排放罐内液体，排放罐内气体，关闭循环水泵。 注：开搅拌时应使罐

8、内装有不少于1/3全容积的液体，以免搅拌浆因空载引起晃动，造成搅拌轴变形甚至引发意外。2 消毒灭菌2.1 配料 夹套中充满水，标定罐重；提前称好培养基中各成分，用部分水溶解；关闭底阀，打开接种口盖，从接种口向罐内注入待消毒料液，根据罐重显示数据加水至消前体积，搅拌均匀，关闭接种口，再适当旋松。2.2 自动在位灭菌4 补料 准备好所补物料，加入到补料瓶中，将针头与补料瓶出料管用硅胶管可靠连接，并将针头用纱布、牛皮纸按无菌消毒要求严密包扎，为防止消毒降温时料液经胶管溢出，需将胶管中间近料瓶端夹死。消毒灭菌，保压结束降温时注意不要泄压过快，以免料液冲出造成污染。将准备好的所补物料胶管放入相应蠕动泵压

9、槽中，设置好相应的补料参数。开始补料前，松开近料瓶端的夹子，用酒精棉球擦拭补料口，点燃，迅速将针头插入。注：因补酸碱时，发酵液实际pH与pH探头探测的酸碱数有一定时间差，所以若设备自动调节酸碱，则常常超出设定值，须来回调动而造成酸碱浪费，且影响工艺。5 放罐与清洗放罐：发酵完毕，将发酵液从底阀和取样放料阀放出，按工艺要求另行处理。清洗：发酵罐清洗须严格按照设备清洗SOP进行，清洗前小心取下pH电极和溶氧电极，将pH电极浸入3mol/L的KCl溶液中，溶氧电极浸入蒸馏水中。6 检查与维护检查：清洗完毕，一定要检查各阀门及计算机控制系统是否如要求开关，各接口是否有泄漏等。维护：若发现问题，须及时处

10、理，并做好相应记录。温度对发酵生产的影响总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑，最终是为了获得最大的发酵得率。温度对发酵生产的影响1、温度影响反应速率 2、温度影响发酵方向3、温度影响基质溶解度 4、温度影响产物合成发酵过程引起温度变化的因素发酵热 发酵过程中所产生的热量，叫做发酵热。 Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射生物热 来源 ：微生物对营养物质的分解所释放的能量 影响因素：菌株培养基成分 发酵时期 pH对生长的影响机制对E合成的影响对E活性的影响对ATP生产率影响： 影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜的渗透性的变化，因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的分泌。影响培养

11、基某些重要营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用 pH对产物合成的影响产物合成阶段的最适pH值和微生物生长阶段的最适pH往往不一定相同，这不仅与菌种特性有关，还取决于产物的化学特性。pH影响代谢方向：pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。pH对微生物生长的影响调节PH方法配制合适的培养基，有很好的缓冲能力；发酵过程中加入非营养基质的酸碱调节剂(NaOH、HCl、 CaCO3)；发酵过程中加入生理酸性或碱性基质； 酸性基质：铵盐、糖、油脂、玉米浆(脱NH4) 碱性基质：NO3盐、有机酸盐、有机氮、氨水、尿素 原则: 残糖高时，不用糖调pH 残N

12、高时，不用生理盐调pHpH控制与代谢调节结合起来，通过补料来控制pH溶解氧控制的工艺方法供氧方面：提高氧分压（氧分含量）改变搅拌转速：通过改变KLa来提高供氧能力 提高通气速率：但增加有上限，否则会引起“过载”、泡沫提高罐压：但同时会增加CO2的溶解度，影响pH及可能会影响菌的代谢，增加对设备的强度要求。耗氧方面 限制性基质的流加控制（补料控制）：在OTR一定情况下，控制基质浓度，控制溶解氧补料对发酵生产的影响补料的目的解除基质过浓的抑制解除产物的反馈抑制解除分解代谢物阻遏作用避免因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多而造成波谷现象。在生产上，补料还经常作为纠正异常发酵的一个重要手段。补料的内容补充微生物能源和碳源补充菌体所需要的氮源补充微量元素或无机盐添加前体、诱导剂等 补料的原则就在于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。泡沫对发酵生产的影响泡沫的产生通气和搅拌代谢气体的逸出存在稳定泡沫的表面活性物质泡沫的不利影响