方法验证课件

1、分析方法的选择和验证周立春主要内容1、原料药及制剂产品所涉及的主要分析方法2、含量和杂质分析方法的研发3、强力降解试验以及降解途径的研究4、不同分析方法验证项目的要求5、药典含量及杂质检测方法的确认与验证要求6、其他来源或内部研制的分析方法的验证7、杂质及残留溶剂分析方法的验证2022/9/3药物研发的要求杂质情况主成分情况安全有效质量可控什么样的药物是安全的？如何证明药物是安全的？什么样的药物是有效的？如何保证药物的有效性？方法选择与验证好药标准情况研究对象是什么？研究目的是什么？如何达到目的？达到何种程度？2022/9/3质量源于设计（QbD）以解读关键物质属性（CMA）为基础通过试验设计

2、(DOE)解读产品的关键质量属性(CQA)确立关键工艺参数（CPP）建立能满足产品性能的且工艺稳健的设计空间（DS），建立质量风险管理（风险评估）确立质量控制策略和药品质量体系药品质量流程技术层面 研发 审评操作层面 生产 监管 通过质量源于设计（QbD）的理念有机的整合在一起药物主要成分(API)的特点结构特点 化学结构，异构体，多晶现象理化特性 外观（色，嗅，味） 溶解性 理化常数（相对密度、馏程、熔点、凝点、比旋度、折光率、粘度、酸值、皂化值、羟值、碘值、吸收系数）药物作用和药代动力学特点 吸收，分布，代谢，转化由结构引出的药物的结构特点决定了药物作用药物的结构特点决定了代谢方式药物的结

3、构特点决定了稳定性药物的结构特点决定了质量控制构效关系特点1）1、4二氢吡啶是活性必须结构，如果转变为吡啶，或六氢吡啶，则活性消失。2）二氢吡啶环上的氮没有取代，活性最佳。3）二氢吡啶环上3、5位上的羧酸酯类也为活性所必须，所取代酯基不同，活性优于相同的取代酯基。4）3、5位取代酯基不同，4位形成手性中心，其中S构型活性最强。仿制药对原研制剂的解读一、药物主要成分(API)的特点二、药物作用与药代动力学特点三、专利的解读四、药物制剂的特点（有效性）五、药物有关物质的特点六、药物稳定性研究提供的信息七、药物包装的特点【鉴别】【检查】【含量测定（效价）】【性状】 UV、旋光、密度、熔点化学、UV、

4、IR、NMR、旋光HPLC、GC、容量法、酶法、生物测定法质量标准中常见检测方法化学、比色、pH、HPLC、GC、TLC、IC、CE、溶出（释放）度、原子吸收、水分仪器有确定的技术指标，经过检测证实其适用于需要验证的方法证明方法能够实现预期目的，按预期要求运行保证系统运行能够达到预期目标，得到准确实验结果证明样品分析结果的准确性系统适用性试验质量控制检查分析仪器确认分析方法验证影响数据质量的因素检测方法的选择适用性先进性经济性通用性方法与技术的“更新换代”方法能够满足实验室间方法传递的要求方法能够充分反映质控目标方法准确、灵敏、简便、易行杂质的检测方法物理常数测定法 旋光度- 检查具有光学活性

5、的杂质紫外分光光度法 杂质吸光度-在特定波长具有紫外吸收的杂质容量滴定法 游离脂肪酸、过氧化物、还原糖重量法 酸中不溶物、水中可溶物 比色比浊法 游离淀粉、碘化物、铁盐、氯化物、硫酸盐等杂质的检测方法原子吸收分光光度法： 检查金属杂质毛细管电泳法：抑肽酶中检查去丙氨酸-去甘氨酸-抑 肽酶和去丙氨酸-抑肽酶两个特定杂质 色谱法：液相色谱法，检查有机杂质的主要方法 薄层色谱法，作为液相色谱法的补充 气相色谱法：检查挥发性杂质热分析法：检查不同晶型的杂质（影响生物利用度和 稳定性） 拉曼光谱法、红外光谱法、X-射线粉末衍射生物检定法、酶联免疫试剂盒（抗生素残留量） 含量和杂质液相分析方法的选择含量与

6、杂质分析是否采用同一个条件HPLC or UHPLC or 2DLC or GC正相 or 反相 or HILICIC or CE or 离子对含量与杂质采用何种检测器UV检测器是否ok折光、ELSD、CAD、NQADCD 、EDMS？前处理方法是否有效？杂质与含量测定的特点分析杂质含量测定专属性与主成份与已知杂质均应分离主成份与杂质分离准确性检出是第一位的准确是第一位的精密度方法可以达到的误差误差越小越好范围宽窄2022/9/3硫酸氢氯吡格雷的色谱条件比较美国药典色谱柱： L57，在粒径5m，孔径120的硅胶上键合手性识别蛋白（卵类粘蛋白）制得。推荐色谱柱：Ultron ES-OVM （信和

7、化学）检测波长：220nm流动相：磷酸缓冲液-乙腈（75:25），等度系统适用性试验：分离度2.5，RSD1.0%限度：A0.2%;B0.3%;C1.0%;未知0.1%；总杂1.5%.特杂：外标。英国药典色谱柱： C18，推荐色谱柱：封端色谱柱检测波长：220nm流动相：戊烷磺酸钠-甲醇（pH2.5），梯度系统适用性试验：分离度，峰谷比大于10限度：A0.2%;B0.3%; 未知0.1%；总杂0.5%. C0.5%; 外标。手性柱“量体裁衣”方法学验证分析方法验证的法规要求方法验证的目的证明所采用方法适合于相应检测项目的要求，能够真实反映产品质量，做到质量可控！新分析方法用于常规检测前必须验证

8、方法转移到新的实验室后需要进行重现验证（或方法确认）新药申报，质量标准中的分析方法必须验证！生产工艺变更、制剂组分变更、分析方法修订时，质量标准中的分析方法必须验证！方法验证的指导原则中国药典2010年版二部附录XIX AICH Q2（A/B）FDA cGMPs 211.165，211.194USP 通则, ,(草案)2022/9/3方法验证的步骤USP规定实验室应采用试验方式进行方法验证：“应通过实验室的研究制定成一定的分析方法验证程序，证明方法的性能参数符合预期的分析应用要求。”验证过程应满足以下条件：易于使用；能够用计算机系统自动控制；每次分析的成本；样品能量；运行时间；以及环境、健康和

9、安全要求2022/9/3验证项目及内容不同项目验证内容不同！以证明方法适用为根本目的！项目内容鉴别杂质定量测定杂质限度检查含量测定及溶出度测定准确度+精密度+重复性+中间精密度+专属性检测限定量限线性范围耐用性 已有重现性验证，不需验证中间精密度。 如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。 视具体情况予以验证。2022/9/3方法验证的筹备防止不必要的失误用于测定关键验证参数的化学品，应具备足够的数量，足够稳定，并且按照技术指标核查其具有确切的成分和纯度。其他材料和消耗品也应符合要求。应选用新的并且符合色谱柱性能指标要求的色谱柱（防止材料导致的失败）分析设备应有明确的规定和良好的性能，并

10、经过确认或校准，以确保其满足分析方法要求的功能和性能指标。应选择中等性能的设备，而不要选择性能最好的设备。否则，用不同设备进行中间精密度和重现性研究时可能会有问题，不容易满足标准限度的要求。操作人员应对技术和设备足够熟悉。这样，他们可以更容易地识别和诊断不可预见的问题，并且更加高效地完成整个过程。2022/9/3分析方法验证顺序没有标准程序！专属性重复性（RT、Area）线性、定量限、检测限、范围准确度中间精密度（重现性）耐用性部分数据可以套用！说法不一！斟酌考虑！2022/9/3方法验证项目的要求保证分析方法能够用于在研药品的质量控制专属性有其他成分（杂质、辅料等）存在时，拟定的方法能否准确

11、（分离）测定出被测物；反映方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力；指用于复杂样品分析时是否受到相互干扰。分别分析加有杂质、降解产物等控制成分的样品和实际样品，比较两组测试结果空白无干扰主成分与有关物质完全分离（分离度r 1.5）峰纯度符合规定（ 980）考虑基质(辅料、水、食品等)对专属性的干扰，关注样品制备减少干扰的发生。2022/9/3方法验证项目的要求专属性鉴别与可能的共存物或结构相似物质相区别空白辅料、结构相似物以及其他组分均呈负反应含量测定、杂质检测提供代表性色谱图 预判的杂质图 粗品的杂质图 破坏的杂质图2022/9/3降解试验以及降解途径的研究降解条件选择酸、碱、氧化浓度、

12、温度、时间高温、高湿、光照时间、光强分离条件的优化峰纯度分离度主要降解杂质鉴定降解程度控制降解510%至少有一个条件降解与非降解品比较；体现考察摸索和研究的过程，2022/9/3专属性的研究如何评估和利用强力破坏及影响因素的试验数据 结构特点与降解方式 物料平衡 检测波长的合理性 建立系统适用性试验：以保证系统的可重复性。关于物料平衡的概念在液相检测有关物质时的物料平衡：应该是指经过各种破坏试验后，或加速实验及长期稳定性试验后，主成分峰面积的减少与杂质峰面积的增加之间的平衡，以确定检测方法的准确性，以及杂质含量的计算方式的考量。 某制剂的加速试验数据0月有关物质含量测定1月0.32%101.6

13、%2月0.42%98.9%3月0.48%97.2%6月0.53%95.4%结构特征的预判当结构中某种基团应有的问题在专属性试验中没有出现时。例：奥拉西坦色谱系统的调整是必须的 色谱柱 流动相方法验证项目的要求专属性尝试选择合适的色谱柱或色谱条件获得方法的专属性评价目标色谱峰纯度（二极管阵列检测器、MS）当共洗脱化合物的光谱图非常接近时，紫外-可见二极管阵列检测器就有其局限性，这在代谢物及其母体化合物时极有可能发生2022/9/3方法验证项目的要求专属性当共洗脱化合物的光谱图非常接近时，采用MS检测器质谱通常比紫外光谱专属性更强，因此常用于色谱的选择性评价2022/9/3方法验证项目的要求专属性

14、猪去氧胆酸+胆酸胆酸 m/z=391.44猪去氧胆酸m/z=407.43胆酸m/z=407.38胆酸异构体？胆酸猪去氧胆酸2022/9/3法莫替丁氯化钠注射液（有关物质）原国家标准方法等度洗脱结果：23.6%2010年版方法梯度洗脱结果：28.3%厂家批号2010年版原国家标准最大单个杂质%有关物质总量%最大单个杂质%有关物质总量%1060301A1.73.70.81.8 060301B1.73.90.92.0 060301C1.94.00.91.9 20604091.76.40.93.0 0604151.86.80.92.9 0604161.96.60.82.6 3060214012.57.

15、70.71.7 060214022.58.11.01.7 060214032.57.60.91.7 4200603080110.228.3 9.023.6 20060218039.928.2 8.322.9 200602180414.835.5 9.727.9 5060721010.62.4 060817010.62.6 060815010.62.7 606030161.74.4 0.51.5 06030171.84.6 0.51.3 06030181.64.4 0.71.6 方法验证项目的要求系统适用性系统适用性进样精密度RSD X %分离度的要求 -杂质对照品法 -混合对照品法 -化学降解

16、法 -相对保留时间法主峰拖尾因子X理论板数的要求2022/9/3方法验证项目准确度原料药利用已知纯度的对照品或样品进行测定与已建立准确度的另一方法测定结果进行比较（容量法！）制剂空白辅料+对照品制剂+对照品（无法获得空白辅料）2022/9/3回收率的做法和评估做法：将一定量杂质加到原料或制剂中，制成高、中、低三个浓度（在线性覆盖的范围内），每个剂量取三份样品，按拟定方法测定回收率（注意扣除本底）。评估：根据精密度的考核情况和回收率的数据综合评价主成分，辅料、其他有关物质以及方法本身对测定结果影响情况。根据回收率的平均值和9份数据的RSD值进行评估含量测定准确度接受标准容量分析法：原料药精制品（

17、99.5%）或对照品考察精密度RSD0.2%；回收率99.7100.3%UV法：精制品考察精密度RSD1%；制剂回收率98102%；线性吸光度在0.20.7，r0.9999(n 5)，截距近于零。HPLC法：精制品考察精密度RSD2%；制剂回收率98102%；线性r0.999(n 5)，截距趋于零准，不精不准，精准，精2022/9/3方法验证项目的要求精密度精密度同一样品多次测定结果的接近程度重复性 6份供试液（100%浓度），含量RSD 2.0%（n=6）检测范围内，3水平，9样品测定（回收率结果）中间精密度 （与重现性“二选一”）6份供试液，双人双机分别测定，含量RSD 2.0%（n=12

18、）人员、仪器、操作条件、试剂、色谱柱等因素影响重现性不同实验室，不同人员测定结果的精密度（方法通用性，方法转移）2022/9/3精密度的做法和评估按正式质量标准操作，以文字稿为准。评估：计算测定的相对标准偏差进行评估。 误差来源： 供试品溶液的配制方法（称样和提 取） 测定方法的误差 色谱峰的响应值大小 色谱峰的形态 杂质的限度 方法验证项目的要求灵敏度（检测限）检测限被测物能够被检测出的最低浓度或含量。限度指标，无需定量。目视法：能够可靠检出的被测物的最低浓度或含量(结果记录！)信噪比法：仪器分析法(计算基线噪音)，s/n 3标准差法(I)：A3 (n6) A:平均峰面积；：偏差标准差法(I

19、I)：空白=0：测背景噪音(n10)，计算标准差；计算标曲上3对应的浓度，即为检出限空白0：测背景噪音(n10)，计算标准差；计算标曲上(Y截距+3)对应的浓度，该浓度即为检出限空白0：测背景噪音(n10)，计算标准差；计算标曲上3对应的浓度，X截距+该浓度即为检出限2022/9/3方法验证项目的要求灵敏度（定量限）定量限被测物能够被定量测定的最低浓度或含量，结果应准确和精密。信噪比法：仪器分析法(计算基线噪音)，s/n 10标准差法：A10 (n6) A:平均峰面积；：偏差六份定量限溶液，主峰保留时间RSD 2.0%；主峰峰面积RSD 2.0%工作站计算信噪比，注意选取参比时间色谱图显示s/

20、n2022/9/3检测限和定量限所给出的信息检测方法可以准确测定的浓度供试品溶液浓度的设计灵敏度溶液与报告限的必要性方法验证项目的要求线性线性被测物浓度与结果之间呈正比关系的程度回归方程（最小二乘法；一次、二次、双对数）80%120%；定量限120%n6（至少五个点，均匀分布）r 0.998Y截距在100%响应值的2%内响应因子RSD 2.0%2022/9/3方法验证项目的要求范围范围达到一定精密度、准确度和线性下，测试方法使用的高、低浓度或量的区间根据分析方法具体应用和线性、准确性、精密度验证的结果和要求确定一般用与检测结果相同的单位表述（百分比、百万分之几）。含量测定：80%120%含量均

21、匀度：70%130%杂质：报告值（定量限）限度120%溶出度：范围20%（下限-20%上限+20%）线性回收精密度范围2022/9/3方法验证项目的要求耐用性耐用性实验条件略有变动，是否影响检测结果；衡量城规情况下实验结果的重现性；如方法易受影响，应着重注明！供试品溶液与对照品溶液 -关注溶液稳定性影响（不同储存时间的样品和对照品溶液与新制 备对照品溶液的比对结果分析） -关注提取条件影响！2022/9/3方法验证项目的要求耐用性色谱条件的考察： -流动相比例变化(5%)、 -pH变化(0.2)、 -柱温变化(5)、 -流速变化(20% )、 -检测波长（2nm） -色谱柱：不同品牌 每条件测

22、试2次2022/9/3供试品溶液配制的耐用性评估供试品溶液的稳定性 评估杂质的成长程度供试品配制过程的稳定性 各种提取、加热、超声方式对杂质的检测的影响 评估杂质的成长程度色谱柱原则：方法验证时进行粗放度试验（三根以上色谱柱），特殊填料应在各论中予以注明，强调“或效能相当”。大多为反相高效液相法，采用C18、C8、苯基等键合硅胶填料，以C18为最常用；目前C18色谱柱类型也很多，不同基质、不同载碳量、不同封端处理方式、不同纯度、不同粒径、孔径、柱长等，影响因素较多，方法研究时应注意粗放度考察；色谱柱的差异Minutes515253545Symmetry C18Al conc. 10 ppmTF

23、 USP = 1.9AmitriptylineNova-Pak C18Al conc.= 375 ppmTF USP = 6.4低金属不纯物的含量主要成分（API）的结构特点色谱柱的差异 Inersil（ ODS-2，5m，4.6mm250mm）柱色谱图. 迪马公司（钻石，5m，4.6mm250mm）柱色谱图色谱柱的差异资生堂MG5m，4.6mm150mm色谱柱图谱 Waters(XBridgeTMShield RP18 5m，4.6mm250mm)柱色谱图 耐用性的评估供试品溶液的选择评估的项目 杂质分离情况 色谱峰的拖尾状况 杂质个数 杂质量的变化（已知杂质、未知杂质、 杂质总量等） 杂质

24、谱的比较 相对保留时间的变化 校正因子的变化方法确认和转移方法验证主要在产品开发阶段完成生产后的验证包括方法确认和方法转移方法确认：本单位生产的产品是否符合变更后的国家标准或药典标准关注新旧方法的区别确认新方法的接受标准对实际样品和稳定性样品进行考察注意应及时与药典委员会沟通方法转移：记录一个实验室（接收方）能够使用由另一个实验室（转移方，也称作转出方）所开发检验方法的过程，并确保接收的实验室知道检验的程序并有能力按规定进行检验。2022/9/3方法验证药典 vs 自订仿药典方法还要方法验证么？肯定要！（方法确认）关注重点在专属性，原料来源、工艺是否不同，辅料是否干扰等等是否有新的或超标准的未

25、知杂质？自拟方法的方法验证全部需要验证根据方法检测目标合理设置验证参数检查？含量测定？限度？定量？2022/9/3杂质谱分析方法建立根据主成分及杂质的理化性质、化学结构、杂质的控制要求，采用适当手段将杂质的信号放大，易于辨认和定量。化合物结构特征、理化性质、剂型特征、工艺过程、标准要素综合设计、严谨研究、规范验证。专属、灵敏、准确、简捷。分析方法的有效性分析方法各有局限，注意不同原理分析方法间的相互补充和验证。杂质谱分析方法建立方法的选择不同原理方法比较方法的最优化色谱系统选择杂交色谱（柱串联）二维色谱新技术应用（HILIC）检测器的选择UV、DAD/ ELSD、CAD、NQADIR / MS

26、杂质谱分析杂质比较与谱峰归属比较方法图谱叠加平行列表逐峰比较结果报告新杂质（个数、单个最大、总量）单一新杂质量（0.1%？、0.2%？）新杂质总量所占比例峰序号溶剂峰对照药自制品峰性质新增杂质总量10.20.20.2溶剂峰24.2/0.2%新增杂质38.2/0.5%8.2/0.3%原有杂质411.8/0.5%苯乙胺518.2/0.5%新增杂质（苯乙醇）杂质总量1.2%1.0%0.7%杂质谱分析阿奇霉素中可能的杂质：37种原料：红霉素 A、红霉素 B、红霉素 C、红霉素D、红霉素 E、红霉素 F、阿奇霉素B、阿奇霉素C、阿奇霉素E、阿奇霉素F中间体：红霉素A肟（Z）、6，9-亚胺醚、氮红霉素A、

27、红霉素A肟（E）、红霉素 C肟（E）、9，11-亚胺醚、红霉素C 6，9-亚胺醚、红霉素A内酰胺 副产物：红霉素-N-氧化物、N-去甲基红霉素A、N-去甲基阿奇霉素A、氨基阿奇霉素A、N-甲酰基-N去甲基阿奇霉素A、N-去甲基-N-苯磺酰基阿奇霉素、阿奇霉素N-氧化物、3-去（二甲氨基）- 3,4-去氢阿奇霉素、 O-甲苯磺酰基红霉素肟、红霉素Z肟重排物、氮红霉素11，12-硼酸酯、 N，N-去二甲基N-甲酰基阿奇霉素A、丙基阿奇霉素、3-N， N-去二甲基氨基-酮基阿奇霉素A、阿奇霉素11，12-硼酸酯降解产物：去克拉克定糖阿奇霉素A、去克拉克定糖氮红霉素、红霉素8， 9-脱水-6，9-半缩

28、酮、红霉素6，9：9，12-螺缩酮系统图实际图杂质研究关键点测定值是否真实反映杂质的含量？申报资料中“HPLC检测波长的选择”问题 (a)直接将主药的最大吸收波长选作检测波长; (b)简单地套用含量测定的色谱条件。实际仍是以主药的最大吸收波长作为有关物质检测波长; (c)以样品进行破坏性试验（酸、碱、热、光照、氧化等）后的溶液做紫外扫描。由于未破坏主药所占比例较大，故破坏性试验后溶液的最大吸收波长一般仍为主药的最大吸收波长。若盲目地将主药的最大吸收波长确定为检测波长，则杂质在此波长下的吸收可能偏低；某些杂质甚至无吸收，这样会造成对杂质含量的低估甚至漏检，从而不能反映产品的真实质量。无紫外吸收或

29、检测波长处吸收相差较大的多种化合物，有时在单一检测波长处不能检出检测方法的选择！杂质研究关键点测定值是否真实反映杂质的含量？HPLC波长选择解决方案对产品中可能存在的杂质（合成原料、中间体、副产物以及降解产物）的紫外吸收特性进行研究。已知杂质的紫外吸收特性可采用对其流动相溶液直接进行扫描的方法考察;未知杂质（如未知降解产物等）可通过二极管阵列检测器考察其紫外吸收情况。根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检测波长。若对不同杂质难于找到均适宜的检测波长：选择在不同波长下分别测定，采用加校正因子的主成分自身对照法。改用通用检测器（ELSD、CAD、NQAD）有

30、关物质检测波长的确定(实例)头孢地嗪通过采用DAD检测器在不同检测波长检测各种破坏试验的杂质变化情况，发现有的杂质在215nm和262nm的紫外吸收不同。在215nm的吸收与主峰的吸收接近，因此检测波长定在215nm。破坏试验不同波长的杂质变化加速破坏条件(0.5mg/ml样品溶液)有关物质(%)波长215nm254nm262nm未破坏单个0.180.170.17总量0.360.330.30加0.1mol/L盐酸1ml，放置7小时，加0.1mol/L氢氧化钠1ml单个4.05.24.8总量10.67.46.5加0.1mol/L氢氧化钠1ml，放置30分钟，加0.1mol/L盐酸1ml单个5.8

31、6.56.7总量10.38.48.24000lx光照24小时单个1.91.81.6总量4.83.52.9水浴30分钟单个12.510.59.3总量37.126.724.1加30%过氧化氢1ml，放置24小时单个5.45.55.6总量8.18.08.2头孢地嗪的紫外吸收图杂质之一的紫外吸收图杂质研究关键点多种方法联用由杂质多样性复杂性和方法局限性所决定。单一方法不能满足多个杂质的检测时，可采用两种或两种以上的方法互为补充。化学法、色谱法、光谱法、生物检定法同一方法采用不同的测试条件，如正相HPLC、反相HPLC、不同流动相的反相HPLC等分离技术与检测手段联用，较为有效，如HPLC、GC、LC-

32、MS、GC-MS、HPLC-DAD、CE等多维色谱（HPLC-IC）多检测器联用（LC-DAD-CAD-MS）杂质研究关键点检测方法的规范性验证专属性：原料药合成中间体、粗品等的分离度考察原料药及制剂的强制破坏实验制剂辅料干扰实验杂质加入实验与药典或经过论证的其他方法比较峰纯度检测（DAD/MS）杂质研究关键点检测方法的规范性验证灵敏度：通常用检测限及定量限表征直观评价、信噪比、响应值的标准差和斜率获得。关注杂质紫外吸收特性，确定适宜波长；判断是否需要采用杂质对照品精密度：重复性(在相同条件下由同一分析人员测定所得结果的精密度)中间精密度(在同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果

33、的精密度)重现性(在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度)杂质研究关键点检测方法的规范性验证准确度：已知杂质：回收率（根据精密度、专属性、线性）推断未知杂质：与另一成熟方法比对、根据质量平衡原理结合含量等结果进行粗略判定，必要时研究几种不同色谱条件甚至不同测定原理的方法进行比较选用线性：在设计范围内，响应值与待测物质量之间成正比例关系的程度。范围：检测方法能达到一定精密度、准确度和线性的高、低浓度或量的区间范围应在规定限度的20%间或定量限至限度的+20%间，若含量测定和杂质检查同用一套色谱系统，则线性范围应为杂质限度的-20%至含量限度（上限）的+20%间耐用性：指测定条件有小的变动时，

34、测定结果不受影响的承受程度杂质研究关键点定量方法的选择杂质对照品法加校正因子的主成分自身对照法不加校正因子的主成分自身对照法峰面积归一化法优点定量准确定量准确，无需长期提供对照品可用于未知杂质简便特点需用杂质对照品杂质与主成分的响应值超出0.91.1范围，假定杂质与主成分的响应因子基本相同，响应因子在0.91.1之间可用；有一定误差；假定杂质与主成分的响应因子基本相同，响应因子在0.91.1之间可用；有一定误差；线性范围要宽对象已知杂质已知杂质已/未知杂质已/未知杂质杂质研究关键点限度的确定杂质限度:药品质量控制的重要指标之一，临床用药的安全性的重要保障；反映药品生产工艺水平、产品的稳定性、有

35、效期的重要指标。限度确定的核心：杂质是否安全！指导原则（决策树）杂质安全性研究相关文献资料杂质安全性研究资料被仿品质量标准中杂质“数”和“量”的情况上市品杂质不得超过安全性研究样品中杂质水平残留溶剂分析原料药、辅料或制剂生产过程中使用或产生的在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂根据毒性分为四类一类溶剂致癌物、意思致癌物或环境危害物 必检二类溶剂非遗传致癌毒性或其他不可逆毒性或严重的可逆毒性 必检三类溶剂低毒 研究终产品精制步骤的残留四类溶剂无足够资料2022/9/3残留溶剂的特点有机挥发性化合物药品生产过程中使用过生产中应除去而未除尽种类相对固定不同样品、不同产地、不同工艺具有不确定性残留量相对

36、较低，微量或痕量分析同一样品中不同溶剂残留量相差较大2022/9/3残留溶剂的研究过程确定研究溶剂种类确定溶剂类别确定限度选择测定方法干燥失重/GC/HPLC(吡啶)/IC(N-甲基吡咯烷酮)/GC-MS选择色谱柱和检测器方法建立及条件优化方法学验证建立质量标准2022/9/3残留溶剂分析方法首选方法GC顶空进样 VS 直接进样毛细管柱 VS 填充柱FID检测器极性柱 VS 非极性柱等温 VS 梯度升温2022/9/3残留溶剂分析方法直接进样高沸点溶剂介质为：水或其他挥发溶剂顶空进样低沸点溶剂介质为：水或其他挥发溶剂、不挥发性酸碱2022/9/3残留溶剂方法验证专属性系统适用性线性（定量限限度

37、+20%）精密度LOD & LOQ准确性（回收率）耐用性2022/9/3残留溶剂方法验证注意不要尽信溶剂供应商的纯度信息！不要尽信工艺信息不放过任何一个信号峰辅料的溶剂残留必须考虑方法不能照搬药典！内标干扰溶剂差异2022/9/3残留溶剂检测的常见问题：共出峰干扰 热降解干扰 基质效应的影响 药品溶解性的影响 溶剂介质的影响 共出峰干扰共出峰： 在相同的色谱条件下具有相同保留值的组分不一定是同一物质。不同的物质在某一色谱条件下具有相同保留值的现象，被称为共出峰现象。不同物质在性能（极性或氢键形成能力等）不同的色谱柱中具有完全相同保留行为的几率很小。因此采用不同极性的色谱柱分别测定，可以排除共出峰的干扰。吡柔比星中正己烷共出峰的排除色谱柱样品批号PS-117PS-118PS-119DB-624柱5.449%6.209%4.794%SPB-1柱0.569%0.631%0.579%热降解干扰如果药品对热不稳定，则可能会在直接进样或顶空加热过程中发生热降解，如果降解产物恰好与待测的有机溶剂共出锋，或恰好就是某种有机溶剂，则会导致把降解产物当作残留溶剂检测，得出错误结果。热降解原因分子结构中有烷氧基的药品可能热解产生相应的醇。排除干扰的办法改变顶空温度可以确定顶空条件下样品是否能产生热降解干扰物。也可以通过测定已