人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析

1、人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第1页第一节 试验目标掌握人类基因组DNA提取基础原理和方法掌握琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA方法人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第2页第二节 试验原理人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第3页相关知识核酸提取思绪： 破膜：细胞膜、核膜 分离：经过酶，有机溶剂，调整pH值，离心等 纯化：去除杂质人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第4页DNA提取标准： 确保DNA一级结构完整性 排除其它分子污染，使其纯度尽可能高 排除有机溶剂和金属离子污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其它核酸分子污染相

2、关知识人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第5页样品起源： 培养细胞 组织标本 血液样本相关知识人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第6页试验原理用细胞裂解液裂解细胞膜，搜集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量DNA。此次试验使用试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附DNA特征，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第7页离心吸

3、附柱内硅基质膜在高盐，低pH值状态下选择性地结合溶液中DNA，再经过漂洗液将杂质去除，最终低盐，高pH值洗脱缓冲液或去离子水将DNA从硅基质膜上洗脱。高盐，低pH值：选择性结合DNA漂洗低盐，高pH值：DNA从硅基质膜上洗脱人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第8页第三节 主要试剂人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第9页主要试剂 培养细胞 RNase A（100mg/ml） ProteaseBuffer GR Buffer GL 无水乙醇 Buffer GW1 Buffer GW2 Buffer GE人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第10页第四节 主要仪器人类基因组dna提取

4、及琼脂糖凝胶电泳分析第11页微量移液器台式微量离心机 电泳仪 凝胶成像系统主要仪器LIFE人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第12页第五节 操作步骤人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第13页 1.样品处理：取1管细胞，做好标识，5000rpm离心3分钟，弃上清，搜集细胞。3.向以上溶液中加入20 l Protease K，混匀。 4.加入200 l Buffer GL，颠倒混匀15次，猛烈震荡最少1分钟。 注意：不要直接将Protease直接加入到Buffer GL。5. 56孵育10分钟，其间颠倒混匀数次6.加入200 l无水乙醇，颠倒混匀10次，猛烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖

5、上 液体集中到管底。第五节操作步骤7.将步骤5所得溶液全部加入到已装入搜集管吸附柱中，一次不能加完溶液，可分屡次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉搜集管中废液，吸附柱重新放回搜集管中。2.加入200l GR，用移液器重复吸打几次，使细胞悬浮。人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第14页10.吸附柱置于一个新离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入60l Buffer GE， 室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟，搜集DNA溶液，-20保留DNA。 7.向吸附柱中加入500 l Buffer GW1，12,000 rpm离心1分钟，倒掉搜集管中 废液，将吸附柱重新放回搜集管中。8

6、.向吸附柱中加入500 l Buffer GW2，12,000 rpm离心1分钟，倒掉搜集管中 废液，将吸附柱重新放回搜集管中。9.10,000 rpm离心2分钟，倒搜集管中废液。吸附柱置室温2分钟，以彻底晾干。第五节操作步骤11.取5 -10l基因组DNA，并加入2 l上样缓冲液，混匀，加样到1琼脂糖凝胶点样孔中，电泳检测分析。人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第15页第六节 注意事项人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第16页（1）试剂配制及保留规范，离心管及Tip头需经高压灭菌处理。（2）基因组DNA长而弯曲，易断裂。操作过程中尽可能轻缓，防止过分 溶液吹打转移，以及过高温度。

7、第六节注意事项人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第17页第七节 结果分析人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第18页第七节结果分析量：越多越好。量越多电泳区带越明亮。质量： a. 纯度越纯越好。A260/A280越靠近1.8越好 b. 分子量越大越好。DNA分子量大于30KB，可满足普通试验要求。1.0琼脂糖凝胶电泳，理想电泳结果:靠近点样孔，落后于Marker最终一条区带(约21KB)位置可见一条明亮区带。区带前方，不应有拖尾（降解），或较弥散小分子量区带（RNA）。人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第19页M: DNA/HindIII+EcoRI DNA Marker；1-5: 基因组DNA基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果图第七节结果分析LIFE21226 bpM12345人类基因组dna提取及琼脂糖凝胶电泳分析第20页课程相关资源人类基因组dna提取