嘌呤类药物作用及巯基嘌呤甲基转移酶遗传多态性的研究进展

1、嘌呤类药物作用及巯基嘌呤甲基转移酶遗传多态性的研究进展目前研究结果说明,治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的抗嘌呤代谢药物6-巯基嘌呤(6-P)和6-巯代鸟嘌呤(6-TG)均是无内在生物活性的药物,必须通过体内一系列代谢后才能发挥抗白血病效应。而人体一种被称为巯基嘌呤甲基转移酶(TPT)的代谢酶在此类药物代谢和抗白血病作用中起关键作用。此酶是存在于哺乳动物和禽类细胞中的一种细胞内酶,非金属依赖性,能利用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SA)作为甲基的供体和底物结合,特异地催化杂环类和芳香类化合物苯环6-位硫原子的甲基化,其内在底物和主要的生物学功能仍然未完全清楚1，2，而其DNA编码顺序上某个核苷酸碱基

2、点突变,是造成嘌呤类药物不同强度的细胞毒作用的根底3。所以,对于TPT酶学特点、其遗传多态性的分子生物学机制以及6-P、6-TG临床关系的研究成为当前研究药代动力学的热点之一。16-P和6-TG的代谢4，56-P的代谢途径：由次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)催化先形成硫基次黄嘌呤单磷酸盐(TIP),硫基黄嘌呤单磷酸盐(TXP),硫基鸟嘌呤单磷酸盐(TGP),后者经磷酸化后分别形成二磷酸盐和三磷酸盐。后三种物质统称为TGNs,它整合到肿瘤细胞中影响DNA的复制及RNA的表达,发挥抗肿瘤作用。6-P,TIP,TGP均可由TPT催化生成甲基化的衍生物6-eP,6-eTGP,6-eTIP,这些甲基化

3、的化合物属于“无活性的物质,它们可以抑制磷酸核糖焦磷酸化氨基转移酶(PRPP-AT)的活性,后者是细胞重新合成嘌呤步骤中的关键酶,因此,抑制PRPP-AT的活性就阻断了肿瘤细胞遗传信息的表达,从而到达抗白血病的作用。由黄嘌呤氧化酶催化形成6-硫基黄嘌呤后再形成尿酸也可生成尿酸排出。6-TG的代谢途径：由HPRT催化直接形成硫基鸟嘌呤磷酸化合物(TGNs)发挥抗白血病作用。也可由TPP催化生成甲基化的产物如6-eTG,或e-TGP,到达抗肿瘤的作用。但组织中TPP对6-TG的催化效力远比6-P低(约为1/12)4，故此过程并非6-TG的主要代谢途径。6-TG由鸟嘌呤脱氢酶催化生成6-硫基黄嘌呤再

4、由黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸排出。2TPT的酶学特点2.1TPT的组成构造：由两个具有一样的催化功能单体组成,说明TPT的构造并非引起遗传多态性的原因。TPT的分子量大约为30000。通过提取和分析人肾脏组织中的TPT,发现它由245个氨基酸残基组成。另有人还发现几乎每个依赖SA的甲基转移酶均含有3个构造保守的序列(tif，)，分别含24-，12-，12-三个单体构造,估计这些序列为酶结合底物的构造域68。2.2TPT的组织分布：人类TPT首先在肝脏、肾脏中被发现,随后陆续地在胃肠道、肺、脑、血液、胎儿、胎盘等组织中发现。成年人肝细胞的TPT浓度和血液组织中几乎呈直线相关。第3个月的胎儿即有TP

5、T的存在,其中第6个月的浓度及活性和新生儿类似,说明TPT的浓度及活性在人体各组织内，甚至肿瘤组织中均存在亲密相关性,测定红细胞中的TPT浓度即可大致估计其它组织的酶活性9,10。2.3TPT的酶学动力学特征：酶活性随孵育时间、底物浓度、pH值和离子浓度、底物浓度(红细胞浓度)的变化而变化11。TPT最正确孵育时间为60分钟10,其它参数符合ihaelis-enten曲线。同时,Krynetski等11发如今一般组织中(肝、肾等)酶作用最正确pH值为7.5,而血液中为6.7。2.4TPT的底物及抑制物：Krynetski等做了18种6-P和6-TG衍生物的酶学实验,包括它们的核苷酸和核糖核酸,

6、描绘了它们的反响特性：大多数的衍生物均可作为TPT的底物,它们的酶促动力学特性均符合ihaelis-enten曲线,发现6-P比6-TG与酶结合的才能强。在所有前体药物(6-P,6-TG)和衍生物中,8-羟基-6-P和6-TG分别是两个药物家系中活性最大者,而它们的核苷酸盐类那么是这些化合物中活性最低的,其原因可能是它们较易被水解。led等10发现当化合物中7,9位被烷基化后,其与酶结合的才能有所加强。同时发现前体药物的K、V和K/V值均比其衍生物低,说明6-P和6-TG并非TPT的自然底物。另外,6-硒基嘌呤(Selenpurine)及其衍生物也可以作为TPT的底物,但是它们的K和V值均显著

7、比硫基嘌呤及其衍生物低。黄嘌呤8位上有-H基者是底物，而2位上有-H那么为抑制物12。除2-H-黄嘌呤外,S-腺苷-L-半胱氨酸、Sinefungin、6-甲基硫基嘌呤、3，4-双甲氧-5-对羟基苯甲酸为TPT的抑制物2。3TPT的遗传多态性从人类T84结肠癌患者细胞中提取分析DNA及DNA寡核苷酸探针筛查文库,发现TPT基因总长为3.4kb,编码序列总长2.7kb,开放阅读框架含735个碱基。国外多个文献调查显示,大约有89%的人TPT酶活性6U/lpRB,属于高活性,而11%的人酶活性为15U/lpRB,属于中度活性。而大约1/300的人活性低于1U/lpRB或其活性无法测出。造成这种结果

8、的原因是编码TPT的核苷酸碱基顺序发生点突变,而是否有染色体易位或丧失尚无文献报道。美国和英国学者已在白种人中发现和克隆出两个点突变位点,分别命名为TPT*2和TPT*3。其中前者是核苷酸序列中第238位的鸟嘌呤(G)胞嘧啶(),使得氨基酸序列第80位的Ala(丙氨酸)Pr(脯氨酸),后者是第460位的鸟嘌呤(G)腺嘌呤(A),第719位的腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G),结果是氨基酸序列第154位的AlaThr(苏氨酸),第240位的Tyr(酪氨酸)ys(半胱氨酸),这样就造成了酶活性的减低或丧失，从而导致在使用6-P时形成高浓度的TGNs,引起明显的造血组织细胞毒性,产生严重后果,甚至引起死亡。两

9、种突变类型中,TPT*3出现的频率占两种类型的70%，而TPT*2占30%13,14。4影响TPT活性的因素4.1种族特异性：美国弗罗里达州黑种人平均TPT酶活性为8.643.47U/lpRB,未发现缺陷患者。而白种人平均为12.33.88U/lpRB,酶活性的分布比例与前述类似15。led等16发现白种人的酶活性平均值为16.8U/lpRB,黑种人那么为14.4U/lpRB(P0.001)。法国人平均15.47.0U/lpRB,其TPT遗传多态性的分布和美国人一样1。新加坡的调查显示,安康华人中TPT的多态性结论和美国人相似,而实际的数值却大大超过了国外报道的结果17。挪威Saai人的平均值

10、为17.03.3U/lpRB,白种人为13.12.9U/lpRB(P0.001),而酶活性的分布比例与前面结果相似18。同时,他们与韩国合作检测韩国人群的酶活性,其结果也类似19。4.2性别：3篇文献报告在白血病患者中女性的酶活性似比男性高,而安康人无明显差异5，8，20。其它的文献结果为无显著差异2，3，17。4.3年龄：文献提示TPT的活性与年龄无相关性9。4.4红细胞寿命及免疫分型：无相关性11。4.5使用6-P前后TPT活性：患者在进展化疗时其体内TPT的活性与用药前相比大约要上升30%,其中以用药前活性最低的患者上升得最快。而用药后约3个月又逐渐回到原来程度,其中下降得最快者是用药期

11、间活性上升最高者5，11。4.6慢性疾病：无相关性11。5TGNs和TPT的关系TGNs和TPT甲基化是嘌呤类药物治疗白血病的两个重要途径,它们之间的关系可以归结如下：高TPT活性的人群形成的TGNs量少,甲基化产物多；低活性的人群形成的量多,甲基化产物少。因此,低活性人群TGNs虽然能产生强烈的抗肿瘤作用,但同时也容易产生毒副作用,引起造血组织的致命损伤；而高活性的人群由于体内的TGNs量少,虽然此副作用弱,但出现复发的机率也大21。66-TG和6-P的临床关系由于6-TG直接衍生为TGNs,而且临床发现患者在使用6-TG时较少出现造血组织毒副作用及具较低复发性,因此,有人建议以它替代6-P

12、。但6-TG可引起门脉高压，与别嘌呤醇合用时引发较高的毒性,而且价格昂贵、半衰期短,所以目前临床医生建议和6-P按需选择性交替使用22。此外,6-P和6-TG的作用机制也稍有不同,前者作用于细胞周期的G1/S期,而后者作用于S/G2晚期,6-P使嘌呤再合成受阻,而6-TG那么使染色体“变性,可能引起严重的治疗后期不良反响,故当患者酶活性低时可适当降低药物剂量,有文献报道将剂量降低90%时所产生的疗效和正常剂量无显著差异。另有文献报道酶活性低患者当降低6-P剂量时假如和甲氨喋呤(TX)联用可产生较好的疗效。其机制为抑制嘌呤合成后产生大量磷酸核糖焦磷酸盐,后者可以整合到细胞DNA中抗肿瘤。而当患者

13、酶缺陷时应大规模减少剂量或选择换用其它药物。由于大多数患者在治疗前其体内TPT活性未知,因此,在用药时较难防止造血组织毒性,加大了治疗的难度及影响疗效。此外,输血可能造成测定时的误差,应引起注意23。7研究嘌呤类药物和TPT的意义进展此项研究的意义在于：测定6-P原发性耐药个体,防止患者对药物不敏感,造成维持治疗期的复发,贸然加大剂量同时也易产生毒副反响。测定TGNs浓度,防止高浓度时患者对药物过度敏感,产生造血组织抑制和肝脏损害,被迫终止维持治疗,使化疗不能长期、规那么、正常地进展,从而容易复发。防止由于造血组织的毒性使得全身免疫才能下降,产生继发感染,引发死亡或其它严重的反响。因此,认识中

14、国人6-P药代动力学,深化研究TPT表现型和基因型,理解其遗传多态性的分布和机制,掌握药物代谢过程中的各种数据,就可针对每个患者不同酶活性和TGNs而制定相应的用药方案,使治疗个体化,进步急性白血病尤其是ALL的远期疗效乃至进步长期无病生存率。参考文献3Szulanski,tternessD,Her,etal.Thipurineethyltransferasepharalgenetis:huangenelningandharaterizatinfanplyrphis.DNABilgy,1996,15:17-30.5LennardL,LilleyanJS,LnJV,etal.Genetivari

15、atininrespnset6-eraptpurinefrhildhdautelyphblastileukeia.Lanet,1990,336:225-229.6HnhelR,AksyIK,Szulanski,etal.Huanthipurineethyltransferase:leularlningandexpressinfT84lnarinaellDNA.lePhara,1993,43:878-887.8KaganR,larkeS.idespreadurrenefthreesequenetifsindiverseSA-dependentethyltransferasesuggestsans

16、truturefrtheseenzyes.ArhBiheBiphys,1994,310:417-427.9PaifiiG,RitiP,GiulianiL,etal.Thipurineethyltransferaseinhuans:develpentandtissuedistributin.DevPharalTher,1991,17:16-23.11KrynetskiEY,KrynetskaiaNF,Yanishevskiy,etal.ethylatinferaptpurine,thiguanineandtheirnuletideetablitesbyheterlguslyexpressedhu

17、anthipurines-ethyltransferase.lephara,1995,47:1141-1147.13TaiHL,KrynetskiEY,YatesR,etal.ThipurineS-ethyltransferasedefiieny:tnuletideassiatedithlssfatalytiativityinauasians.AJHuGenet,1996,58:694-702.14KrynetskiEY,ShuetzJD,GalpinAJ,etal.AsinglepintutatinleadingtlssfatalytiativityinhuanthipurineS-ethyltransferase.PrNatlAadSiUSA,1995,92:949-953.17LeeED,Kal.ThipurineS-ethyltransferaseativityinahineseppulatin.linPharaTherap,1993,54:28-33.20ledHL.entaryninteratinsbeteen6-PtherapyandTPTativity.EurJlinPhara,1995,48:85-86.22LennardL,GibsnBE,NileT,etal.genitalthip