临床免疫学检验：第26章 移植免疫及其免疫检测(第五版)

1、第二十六章 移植免疫及其免疫检测第一节 器官移植与移植免疫特点第二节 HLA配型与应用分析第三节 常见的组织或器官移植第四节 排斥反应的种类及发生机制第五节 排斥反应的免疫监测第六节 常用免疫抑制药物及其血药浓度监测1596年，意大利外科医生成功进行最早一次成功的自体组织移植19世纪初，尝试异体皮肤移植,但因排斥而失败1940年，Medewar证实了同种异体移植排斥是一种免疫现象1954年，美国医生Murray在单卵双生姐妹间进行肾移植获得成功1962年，应用HLA分型技术选择合适的供体，第一次用无亲缘关系的供体肾进行异体移植，获得成功80年代初，由于环孢素A等应用，明显提高了器官移植的成功率

2、，器官移植已广泛应用于临床 移植免疫学的发展史移植（transplantation）：将健康细胞、组织或器官从其原部位移植到自体或异体的一定部位、用以替代或补偿机体所丧失的结构和（或）功能的现代医疗手段移植物（graft）：被移植的细胞、组织或器官供体(donor)：提供移植物的个体受体（recipient）或宿主（host）：接受移植物的个体 自体移植 同系移植 同种异体移植 异种移植 原位移植 根据移植部位分类 异位移植 器官移植 移植物种类分类 支架组织移植 细胞移植根据移植物来源分类移植的类型 移植名称 供者、受者关系 举例 自体移植 同一个体 自体断肢再植，自体皮片移植 同系或同基因

3、移植 同系或同基因 人的单卵双生子间的器官移植 的个体间 同品系小鼠的皮片移植 同种异基因移植 同种不同基因 人与人之间的肾移植 的个体间 不同品系小鼠间的皮片移植 异种移植 异种动物间 狗的器官移植给猩猩 猪的器官移植给狗 移植种类和命名 第一节 器官移植与移植免疫特点（一）移植器官或组织的抗原性（二）排斥移植物的记忆特性（三）负向免疫调节的必要性 一、器官和组织移植的一般规律二、HLA是诱导排斥反应最强的靶抗原 主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）编码的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA），是不

4、同个体间进行器官或组织细胞移植时发生排斥反应的主要成分 在三类HLA分子中，、类分子是触发移植排斥反应的首要抗原，尤其是HLA-DR位点的抗原分子 HLA发挥双重作用：介导宿主抗移植物反应(HVGR); 参与移植物抗宿主反应(GVHR)。 次要组织相容性抗原ABO血型抗原系统组织特异性抗原三、受体对HLA的识别与效应机制第二节 HLA配型与应用分析HLA异质性决定了HLA型别判定方法的复杂性和多样性HLA型别相同或相近个体器官移植成功高 一、HLA分型方法（一）血清学分型法 应用一系列已知抗HLA的特异性标准分型血清与待测淋巴细胞混合，借助补体的生物学作用介导细胞裂解的细胞毒试验。耗时长不同批

5、号抗血清结果常有不同 操作简便易行节约试剂、结果可靠、重复性好 无需特殊设备 优点缺点用于HLA分型的微量细胞毒试验死（着染）细胞（%）记分结果判断0101阴性11202可疑阴性21504弱阳性51806阳性808强阳性0未试验或不能读数微量细胞毒试验判定标准 （二）细胞学分型法 以混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture,MLC）或称混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）为基本技术的HLA分型法。能用本法测定的抗原称为LD抗原（lymphocyte defined antigen）,包括HLA-D、-DP。MLC分为单向MLC

6、和双向MLC 单向法：淋巴细胞(供者，X 线或丝裂霉素 处理) + 淋巴细胞(受者) 培养 淋巴母细胞(判定结果) 双向法：淋巴细胞(供者) + 淋巴细胞(受者) 培养 淋巴母细胞(判定结果) 将已知HLA型别的分型细胞用丝裂霉素C或X线照射预处理，使其失去增殖能力仅作为刺激细胞；而以具有增殖能力的受检者外周血单个核细胞为反应细胞。两者混合培养时，反应细胞可对刺激细胞发生应答而增殖，用3H-TdR掺入法测定细胞增殖强度，从而判断受检细胞的HLA型别。 1. 单向MLC阴性分型法：纯合子细胞分型法（HTC）阳性分型法：预致敏淋巴细胞分型法（PLT）根据选用的刺激细胞类型分为：1阴性分型法 2阳性

7、分型法 反应细胞+某种HLA-DP不同（其他HLA型相同）预致敏淋巴细胞+待测细胞（处理后刺激细胞）混合培养 遗传型不同的两个个体淋巴细胞在体外混合培养时，由于两者HLA不同，能相互刺激导致对方淋巴细胞增殖，故称双向MLC。在此试验中，各自的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞，反应后形态上呈现的细胞转化和分裂现象，可通过形态法计数转化细胞 。2. 双向MLC本法不能判断型别，只能说明供、受体HLA抗原配合程度 （三）分子生物学分型法 分子生物学技术的迅速发展，使得HLA的DNA分型技术应运而生，并在开展DNA限制性片段长度多态性分析、DNA指纹图、等位基因特异性寡核苷酸杂交等基础上，引入多聚酶

8、链反应技术，使HLA分型得以在更精密的水平上进行。 限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析：最早建立的研究HLA多态性的DNA分型技术 PCR-RFLP分型法：对DNA片段进行体外扩增，然后再用限制性内切酶进行酶切分析，可使限制性长度分析的敏感度大大增加 1. RFLP与PCR-RFLP分型法 序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-sequence specific oligonucleotide, PCR-SSO）是以PCR为基础，将凝胶上扩增的HLA基因DNA转移至硝酸纤维膜或尼龙膜，进而用放射性核素或酶

9、、地高辛等非放射性物质标记的寡核苷酸探针与之进行杂交，从而对扩增产物作出HLA型别判断。 2. PCR-SSO分型法 分类：斑点或印渍法反向斑点或印渍法PCR-SSO是类HLA分型应用最广泛的方法， 能够鉴定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因是近年发展起来的一项新技术,将其与PCR-SSO结合应用于HLA分型，可使分型趋于规模化和自动化，尤其在HLA多态性和疾病遗传背景分析等方面更具优势。HLA的基因芯片分型法，实际上是PCR-SSO反向斑点或印渍法的微型化。目前，基因芯片在HLA分型领域的应用尚属起步阶段。基因芯片(gene chip)原理：应用设计的一套HLA等位基因的序列特异

10、性引物（sequence specific primer,SSP）,对待测DNA进行PCR扩增，从而获得HLA型别特异性的扩增产物3. PCR-SSP分型法 HLA基因扩增的特异性包括：座位特异性（locus-specific），如HLA-A、B、-DRB1等；组特异性（group-specific），如DRB1-01、DRB1-02等；等位基因特异性（allele-specific），如DRB1*0401、DRB1*0402等。原理：对ssDNA进行无变性剂的聚丙烯酰凝胶电泳时，因其序列的差异可形成不同的空间构象而导致电泳迁移率的差异，如此可分辨出单一碱基的差异和检测出DNA多态性或点突变，

11、有助于新的HLA等位基因或突变体的发现。 4.PCR-SSCP分型法 单链构象特异性聚合酶链反应（PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP）是以对待测基因PCR扩增为基础，对扩增的单链DNA（ssDNA）的HLA分型方法。特点：PCR-SSCP作为PCR-SSO的补充，在区分纯合子和杂合子基因方面有其独到之处，有利于排除SSO杂交的假性。基本过程：分离待测细胞的DNA，应用座位、组或等位基因特异性引物进行PCR扩增，扩增产物的纯化和测序，测出的基因序列与HLA基因库的DNA已知序列比较，判断待测的HLA型别。 5. SBT分型法

12、基于序列的HLA分型法（sequence-based HLA typing,SBT），通过对扩增后的HLA基因片段通过核酸序列测定来判断HLA型别。金标准二、HLA分型的应用HLA是引起同种异型移植排斥反应的主要抗原供者与受者的HLA等位基因匹配程度决定了移植排斥反应的强弱程度通过HLA组织配型(tissue typing)，选择合适的供者，减轻排斥反应 1.HLA配型供、受者HLA-A和HLA-B相配的位点数越多，移植物存活机率越高供、受者HLA-DR位点相配更重要，因为HLA-DR和DQ基因有很强的连锁不平衡，DR位点相配的个体，通常DQ位点也相配；不同地区HLA匹配程度与移植结果的关系有

13、着不同的预测价值，在欧洲HLA匹配的程度对移植结果的预测性比美国高，因为欧洲人群的近交程度较高 ，导致HLA位点连锁不平衡性削弱。 移植物存活与HLA配型的关系交叉配型采用补体依赖的细胞毒试验(受者血清+供者淋巴细胞) 阳性对照:阳性对照血清可用淋巴细胞免疫家兔获得 阴性对照:阴性血清可采用无受血史的AB血型男性血清根据反应时参与的细胞成分分类： 淋巴细胞交叉配型 T细胞淋巴细胞毒性交叉配型 B细胞淋巴细胞毒性交叉配型 流式细胞法交叉配型 自身交叉配型 结果判读: 交叉配型阳性:表明受者预存有抗供体的抗体临床意义: 交叉配型阳性:即使组织配型好，也不宜进行移植，易发生超急性排斥反应。 在做受体

14、选择时，组织配型差，但交叉配型为阴性，仍可实施移植。 交叉配型常用于肾脏移植2.HLA交叉配型与预存抗体的检测方法方法类型与参与成分需时应用组织配型补体依赖的淋巴毒试验血清学法（HLA抗血清、补体、待测细胞）3hHLA、类抗原鉴定交叉配型PBL交叉配型血清学法（受着血清、供者细胞、补体、有/无AHG）3h检测受者血清中已存在的抗供者抗体TB交叉配型血清学法（纯化的供者T/B细胞、受者血清、AHG）3-6hT细胞： 检测抗HLA I类抗体；B细胞：检测HLA I、II类抗体MLC试验细胞学法（供、受者细胞培养）6dHLA II类抗原相容性CML试验细胞学法（受者细胞、供者刺激细胞作为靶细胞）4h

15、抗供者CTL检测FCC血清学法（受者血清、供者细胞、荧光抗人Ig）3-4h检测非常弱的和无细胞毒性的抗供者抗体自身交叉配型血清学法（受者PBL、T和B细胞以及血清）和FCC3-4h检测非特异的淋巴细胞抗体（自身抗体）HLA抗体筛选HLA I类抗体的筛选血清学法（受者血清、相应的HLA类型T细胞或PBL）3h60细胞HLA I类抗体检测，抗体特异性鉴定HLA II类抗体的筛选血清学法（吸附过的受者血清、用作HLA-DR/DQ分型的B细胞）4h60细胞数加吸附时间HLA II类抗体检测，抗体特异性鉴定CML：细胞介导的淋巴细胞溶解试验群体反应性抗体（panel reactive antibody,

16、PRA）：指用4060人含已知HLA的T细胞或T、B混合细胞，检测待移植受者血清所得到的抗体阳性百分数。检测意义: 用于判断器官移植时受体的敏感程度 高PRA血清:可针对多个HLA抗原发生反应，受体对所接受的移植器 官或组织威胁大注意:应考虑在不同HLA上可能出现的共同表位或称公共抗原（public antigens）与受体血清发生的交叉反应3.群体反应性抗体的检测第三节 常见的组织或器官移植 临床器官移植术的建立至今已有50多年的历史。从肾脏移植到心肺移植、肝脏移植；从完整的器官移植到部分组织器官甚至是细胞移植；从单一的器官移植到器官联合移植。 一、肾脏移植 肾脏移植，创始于1950年，是临

17、床开展最早、应用最多和效果最佳的一种器官移植。 由于免疫抑制药物的不断更新和移植技术的不断提高，肾脏移植患者1年和5年的存活率，分别可达90% 95%和80%90%。 组织配型是肾脏移植前选择供者的重要手段 包括：ABO血型配型 HLA配型 交叉配型肾源选择的原则：以ABO血型完全相同者为好，至少能够相容选择最佳HLA配型的供者器官1.组织配型在肾脏移植中的应用临床观测项目: T细胞总数、CD4/CD8比值和IL-2及其受体的检测，判断排斥反应的发生和评估免疫抑制剂治疗效果 肾组织活检，预测排斥反应的发生 CsA血药浓度检测，指导合理用药，减少肾毒性 2.肾移植受者的疗效检测 疗效监测：受者免

18、疫状态检测二、肝脏移植 肝脏移植手术已经成为治疗原发性胆道闭锁、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、肝炎后肝硬化、酒精性肝病、肝细胞性肝癌、自身免疫性肝病、急性肝功能衰竭以及药物诱导的肝脏损伤等疾病，挽救晚期肝病患者生命的最有效方法。 特点： HLA是否匹配与肝脏移植效果无显著差异机制：肝脏移植时，因HLA不配仅发生较弱的排斥反应，而免疫抑制剂的应用有效控制了排斥反应的发生肝脏移植时仍应尽可能进行HLA配型1.组织配型在肝脏移植中的应用排斥反应发生几率：约2/3的肝移植患者出现过排斥反应的病理学改变，也有8的病例术后发生急、慢性排斥反应，占肝移植致死原因的10%。2.肝移植受者的疗效检测

19、组织病理学特点：肝移植术后第2天，汇管区出现明显的白细胞浸润，汇管区和肝窦的白细胞浸润第7天达高峰，涉及到T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜酸性和中性粒细胞。在浸润的T细胞中CD8+细胞高于CD4+细胞，也见有IL-2R和CD25+的活化T细胞。三、心脏移植与心肺联合移植 在世界范围内，约有300多个心脏中心进行心脏移植，总例数已超过7万，年病例不下3000，1年和5年存活率分别为80%和70%。心肺联合移植已成为人们可以接受的治疗终末期心肺疾病的一种有效方法。ABO血型匹配：避免急性排斥反应的首要条件。HLA I、类分子匹配：移植器官长期存活的重 要因素。 淋巴细胞毒交叉配合和群体反应性抗体检测1

20、.组织配型在心脏和心肺联合移植中的应用 外周血淋巴细胞总数 T、B细胞的转化能力 T细胞亚类百分数及比值 CTL细胞毒作用 细胞因子及其受体表达或转录水平 转化生长因子 NK细胞数及其介导的自然杀伤或ADCC效应 粘附分子及其配体在各类细胞表达情况2.心脏及心肺联合移植受者的疗效检测 免疫监测指标 骨髓和干细胞移植均系非实质性器官移植，其中骨髓移植开展的较早，而干细胞移植正日益受到临床工作者的重视。 四、骨髓与其他来源的干细胞移植特点：可同时发生HVGR和GVHR 分类： 自体骨髓移植、 同基因骨髓移植 同种异基因骨髓移植（多见） 病例较少成功率高 骨髓移植实际上是造血干细胞移植，因此，骨髓中

21、造血干细胞的质和量对移植的成败致关重要。 1.骨髓移植 方法：使用药物动员剂促使造血干细胞从骨髓释放到外周血，从中获取足量的干细胞用于移植，可获得与骨髓移植同样的治疗目的特点：与骨髓移植相比，具有采集方便、供者不需麻醉、移植后造血恢复快，GVHR发生率和严重程度不高等优点。 移植前检测：HLA和ABO血型配型、血常规与骨髓检验、性染色体测定、造血干细胞鉴定和GVHR征象追踪等肿瘤干细胞的发现，提示人们在进行干细胞应用时应该注意生物安全性。2.外周血和脐血干细胞移植 第四节 排斥反应的种类及发生机制移植排斥反应（tranlplantation refection）是针对移植抗原产生免疫应答，从而

22、导致移植物功能丧失或受者机体损害的过程。 排斥反应分类： 超急性排斥反应 急性排斥反应 慢性排斥反应预防措施：ABO血型配型、交叉配型一、超急性排斥反应发生机制：受者体内存有抗供者移植物的预存抗体，与抗原结合，激活补体和凝血系统,导致血管内凝血。预存抗体来源 ：1、供受者之间ABO 血型不合； 2、受者反复多次输血、妊娠或既往作过移植处理措施：重新移植发生时间：血循环恢复后的数分钟至12天内分类：急性体液性排斥反应：抗体激活补体，并有CD4+T细胞参与，导致急性血管炎急性细胞性排斥反应：CD8+CTL细胞的细胞毒作用、CD4+T和巨噬细胞的作用，导致急性间质炎。二、 急性排斥反应 发生时间：移

23、植后数周至数月内，是排斥反应最常见的类型 处理措施：使用免疫抑制剂 直接途径（direct path）:残留于供者移植物内的抗原提呈细胞（过客细胞）对受者机体的免疫系统提供最初的抗原刺激。这种抗原性刺激，来自移植物中树突状细胞和单核细胞等表面富含的HLA-、-类分子 间接途径 （indirect path）:通过受者体内的抗原提呈细胞对具有同种异基因HLA-、-类分子的移植物实质细胞的识别。无论是供者还是受者，其抗原提呈细胞提供的IL-1、IL-6等刺激信号，有助于触发淋巴细胞的活化 急性排斥反应中的两条抗原提呈途径同种移植排斥反应的发生机制三、慢性排斥反应发生时间：一般发生于移植后数月甚至数

24、年 临床特征：对免疫抑制疗法不敏感无特异性治疗方法，最终需要重新进行器官移植 病理特点：血管壁细胞浸润、间质纤维化和瘢痕形成T细胞、巨噬细胞等介导的迟发型超敏反应等免疫损伤。B细胞产生的抗体活化补体或通过ADCC破坏血管内皮细胞。急性排斥反应反复发作所导致的移植物组织退行性变，此与细胞和体液免疫均有关系。非免疫相关因素，诸如局部缺血、再灌注损伤、微生物感染等。受者患有高血压或糖尿病也可促使慢性排斥反应的发生引起慢性排斥反应的因素定义：在骨髓移植时，供者骨髓中的免疫细胞启动以受者细胞为靶抗原的免疫应答反应，引起攻击受者的移植物抗宿主反应。GVHD也可见于脾、胸腺和小肠移植。 四、移植物抗宿主反应

25、发生机制：T细胞起主要作用 IL-2、IL-6、TNF-、IFN-等细胞因子参与 ICAM、VCAM、CD44、ELAM-1等粘附分子参与第五节 排斥反应的免疫监测 排斥反应发生时，受者体内的免疫应答将发生一系列变化，据此，检测机体的免疫状态可帮助诊断或推测排斥反应的发生。一、体液免疫与细胞免疫水平检测的临床意义 特异性抗体水平的检测 相关免疫指标： ABO等血型和HLA抗体 抗供者组织细胞抗体 血管内皮细胞抗体 冷凝集素 测定方法: 交叉配型、补体依赖的细胞毒性试验 血清PRA水平:判断器官移植时受体对移植物的敏感程度， 基于细胞毒性试验的PRA测定，被作为心脏移植前的常规项目， 若PRA超

26、过5，则应进行供者淋巴细胞与受者血清的交叉配型。（一）体液免疫水平检测的临床意义补体水平的检测补体活性与急性移植排斥反应的发生有关当移植物遭受排斥时，补体成分的消耗增加可采用溶血法或比浊法进行检测。补体活性的检测补体的裂解产物，如C3a、C3b、C3d等的测定常用的检测方法有免疫电泳、免疫标记技术 （二）细胞免疫水平检测的临床意义外周血T细胞及其亚类的计数 CD4/CD8比值大于1.20时:预示急性排斥即将发生， CD4/CD8比值小于1.08时:发生感染的可能性很大。 若进行动态监测，对急性排斥反应和感染具有鉴别诊断的意义NK细胞活性测定混合淋巴细胞反应:刺激细胞:灭活的供者的淋巴细胞 反应

27、细胞:受者淋巴细胞 结果显示的是CTL和NK细胞共同作用的结果。 动态监测NK细胞活性则意义更大血清细胞细胞因子测定 IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-等细胞因子的水平均可升高 个体间血清IL-2R的含量差别显著粘附分子及其配体的检测免疫细胞以及血管内皮细胞等细胞膜表面粘附分子及其配体的表达，与急性排斥反应的发生密切相关。诸如ELAM-1、VCAM、ICAM和HLA分子等比较受者接受移植物前后的细胞因子水平环孢霉素A具有肾毒性，血清肌酐值增高，而IL-2R却明显降低血清肌酐值和IL-2R同时增高提示急性排斥反应的发生巨细胞病毒感染时，IL-2R血清含量的升高将更为明显二、尿微量蛋白检测的临床意义 尿微量蛋白检测意义： 判断大器官移植、尤其是肾脏移植时排斥反应的发生 检测免疫抑制药的肝肾毒副作用 1-微球蛋白是能较早反映肾功能损害的指标 尿-1微球蛋白和尿IgG与肾移植受者短期肾功能关系密切尿微量蛋白种类： 血浆蛋白：包括白蛋白（Aib）、IgG、IgA、IgM、轻链（）、2-微球蛋白（2M）、补体C3、1微球蛋白（1M）、2巨球蛋白（2M）、转铁蛋白（TRF）、游离血红蛋白（Hb）、肌红蛋白（Mb）及其他血浆蛋白和酶 非血浆蛋白：肾脏的Tamm-Horsfall蛋白（THP）、SIgA、肾小球基底膜（GBM）抗原等三、急性时相反应物质检测的临床意义 C反应