6.电镜免疫细胞化学技术

1、电镜免疫细胞化学技术基础医学院病理学系李艳茹E-mail: liyr 电镜技术 利用抗原抗体特异性结合原理，在电镜下对组织细胞中的某种成分进行鉴定和定位的方法。多采用标记抗体来检测组织细胞内未知的抗原。概 念1959年 铁蛋白标记抗体1968年 免疫酶标记抗体1971年 免疫胶体金标记抗体 23具有特异性抗体和高亲合力的标记物细胞和组织具有一定的通透性，能够使抗体 和标记物进入细胞内样品中要有足够的抗原物质存在能够较好地保持细胞的超微结构基本要求4免疫电镜技术样品制备特点一、取材与固定1. 取材： 要求组织新鲜，最理想的方法是灌流固定取材。2. 固定剂与缓冲液的选择固定剂：既能保持良好的细胞超

2、微结构，又能保持组织细胞抗原性。缓冲液：多选用二甲砷酸钠缓冲液配制固定剂和漂洗。pH值68之间。它可较快地使细胞呼吸停止，较早地进入细胞内，并具有减缓pH值下降的作用。 5 1.多聚甲醛戊二醛（Paraformaldelyde-glutaralodehyde，PG) 多聚甲醛常用浓度为；戊二醛常用浓度为0.010.05或0.1。因戊二醛对细胞抗原活性有一定的影响，故多采用较低的浓度。固定时间为15min1h。多聚甲醛穿透速度快，对酶及抗原活性影响小。该液经济、简便，固定效果好，较常用。常用的固定剂6 2.过碘酸赖氨酸多聚甲醛 (Periodete-lysine- paraformaldelyd

3、e,PLP) 常用于检测对戊二醛敏感的抗原和固定富含糖类的组织。 3.苦味酸多聚甲醛戊二醛 （Paraformaldelyde-glutaralodehyde,PAPG) 苦味酸穿透速度较快，可改善对细胞膜与胞质的保存。常用的固定剂71免疫染色的方式 免疫染色是免疫电镜技术的关键步骤。染色时机的选择与标本的包埋有关，电镜的免疫染色分为三种方式： 包埋前染色 包埋后染色 冰冻超薄切片染色二、免疫染色8 又称包埋前标记法，标本经前固定后，在厚切片上先进行免疫染色，然后取免疫反应的阳性部位，再经锇酸后固定、脱水、包埋、半薄切片、超薄切片及电子染色的样品制备方法。多用于抗原含量少及对脱水包埋过程敏感的

4、抗原的检测。包埋前染色9优点：免疫染色时标本未经锇酸固定，脱水及包埋过程，故抗原性保存好，免疫反应充分在免疫反应的阳性部位做半薄切片定位，可提高检出率包埋前染色后可选用高温聚合的环氧树脂作为包埋剂 包埋前染色10缺点： 因醛类固定液可使蛋白质交联，大分子抗体及标记物难于穿透组织细胞。解决方法： 1. 尽量选用分子量小的抗体 2. 减薄组织的厚度利于渗透 （1）用振荡切片机切3050m的厚切片 （2）用冰冻切片机将组织切成35m的薄片，免疫染 色后用倒扣包埋法包埋 3. 增加抗血清（特异性抗体）的孵育时间，可达24h包埋前染色114. 采用去垢剂处理组织 （1）用含0.01%皂角素的PG，58

5、min。皂角素为糖类化合物，可与胆固醇结合使膜上形成孔道。因其对膜结构的影响较小，故用于大多数细胞结构的研究。 （2）用0.02%0.04%TritonX-100进行处理。TritonX-100是非离子去垢剂，能除去脂质，多用于细胞骨架的研究。5. 采用冻融法包埋前染色12 又称包埋后标记法，将已固定和包埋的标本制成超薄切片后，再进行免疫染色的方法，也称为载网染色。可用于细胞表面、细胞浆及细胞核内抗原的检测。包埋后染色13优点：细胞超微结构保存较好阳性结果有高度的可重复性一张切片可进行多重免疫染色同一批切片可进行不同目的的观察包埋后染色14缺点：标本经过电镜样品制备后染色，可使抗原活性减弱如选

6、用环氧树脂进行包埋后染色，该切片的免疫反应不易进行，需用10%过氧化氢蚀刻10min，以去除锇酸和增强树脂的通透性，包埋后染色目前常采用低温包埋技术因铜网易与化学物质发生反应，故需选用镍网或金网载网染色时要在湿盒内进行，并注意保持网面的湿润包埋后染色15 环氧树脂 丙稀酸酯(acrylic resin)：具有低黏度、亲合性强和优良的切 割性能，并耐受电子束的轰击及在低温下聚合的特点。 Lowicryl K4M：为低温水溶性包埋剂，较常用。特点是低温下（-35）可保持低粘度；在紫外光（波长360nm）下可聚合；聚合后可在常温下切片；能较好地保存组织结构和抗原性位，减少背景非特异性染色，故多用于免

7、疫细胞化学的包埋后染色。LR white ：为混合的丙稀酸单体，对脂类溶解度低，保存膜结构较好，可耐受电子束轰击，因而可不做支持膜。热聚合60 ，24 h；冷聚合-25 ，加速剂协助聚合。常用的包埋剂16指组织块经过短时间固定后，浸入2.3mol/L 的蔗糖溶液中，以液氮速冻后，在冰冻超薄切片机上切片，再经蔗糖和PBS冻融和漂洗，进行免疫染色。该方法较灵敏，抗原性及微细结构保存好且操作时间短。 冰冻超薄切片染色17 目的： 排除非特异性染色 确定染色方法的特异性 确定操作技术的可信性 对照实验： 1.阳性实验： 用已知存在某种相应抗原的组织切片与待检切片同时染色。已知抗原的组织切片作为对照，其

8、结果为阳性。免疫染色的对照实验182.阴性实验：包括下列实验，其结果均为阴性。空白对照：用PBS代替一抗替代实验：用制备一抗相同种属动物的正常血清或无关 的特异性抗体替代一抗吸收实验：用相应已知抗原与一抗混合，使之沉淀，再用上清液孵育标本阻断实验：先用未标记的特异性抗体孵育标本与抗原结合，再用已标记的同种抗体进行染色免疫染色的对照实验191.增强特异性染色：蛋白酶消化法、抗原修复法、选择合适的抗体稀释度及合适的孵育时间等。2.减少非特异性染色：内源性过氧化物酶可用3%H2O2， 20-30min。内源性生物素采取饱和处理的方法，用亲合素 25g/ml ，15min。静电吸引所致的吸附作用可用与

9、二抗同种动物的非免疫血清（用5-10%PBS稀释）或用2-5%牛血清白蛋白（BSA）封闭。免疫染色的注意事项203.一抗的选用、稀释度及孵育时间4.二抗的选用和稀释度5.显色剂的选择6.显色时间7.缓冲液的选择免疫染色的注意事项211.铁蛋白（ferritin） 铁蛋白是直径为12-14nm的球形蛋白，铁芯直径为5.5-7.0nm。由于铁蛋白在样品中不易分辨，并且正常组织内也含有铁蛋白，近年来胶体金的使用日益广泛，所以现在铁蛋白不常用。电镜免疫细胞化学中的标记物22 2.辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP） 辣根过氧化物酶是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉辅基结

10、合而成的糖蛋白，具有稳定性强和反应特异性高的优点。其作用原理是HRP通过过氧化氢(H2O2)作为受氢体，以还原型3，3-二氨基联苯胺体(DAB) 作为供氢体来催化氧化还原反应。 HRP DAB-H2+H2O2 DAB+2H2O电镜免疫细胞化学中的标记物233.胶体金 胶体金是氯金酸水溶液在还原剂作用下悬浮液。胶体金表面带负电荷的疏水性颗粒，在水溶液中呈溶胶状的红葡萄酒色。它可与蛋白质正电荷间靠静电相互吸引，结合非常稳定。金颗粒直径5-150nm，电镜常选用510nm的球形颗粒。由于金颗粒大小不同，可用于分别标记不同的抗体，双重标记或多重标记；而且可以计数颗粒进行定量分析。电镜免疫细胞化学中的标

11、记物24电镜免疫细胞化学中的标记物25 酶标免疫电镜技术是以酶作为抗原抗体反应的标记物，在既不改变抗原抗体的免疫反应特异性，也不影响酶活性的条件下，与相应的酶底物作用形成具有较高电子密度终产物的技术。酶标免疫电镜技术26 免疫染色系统包括：识别系统: 一抗（特异性抗体）联结系统: 二抗（联结抗体）显色系统: 三抗（酶标抗体）、显色剂免疫染色的方法27（1）直接法（direct method） 用酶标记的特异抗体直接与靶抗原结合，再与酶底物作用产生有色产物（显色）。适用于表面抗原的定位。（2）间接法（indirect method） 将待测细胞或组织切片,先与未标记的特异性抗体结合,再用已标记的

12、免疫蛋白作为二抗与一抗相结合。免疫染色的方法28（3）过氧化物酶抗过氧化物酶法 (peroxidase antiperoxidase method,PAP法) 先用特异性抗体（一抗）与靶抗原结合，再用二抗联结抗体，最后三抗是PAP复合物（即以HRP为抗原，在与一抗同种动物身上诱发的抗体，这种抗体与HRP结合成免疫复合物）免疫染色的方法29免疫染色的方法30 （4）亲合素-生物素复合法 (avidin-biotin complex method, ABC法) 特异性抗体（一抗）与靶抗原结合，用生物素化抗体作为联结抗体，最后三抗是ABC复合物（即亲合素与过氧化物酶标记的生物素复合物）。免疫染色的方

13、法31免疫染色的方法32 (5)链酶亲合素生物素复合法(streptavidin biotin complex method, SABC法) 链酶亲合素是由链酶菌中提取的蛋白质 *特异性抗体（一抗）与靶抗原结合 *联结抗体为生物素化抗体 *三抗为HRP标记的链酶亲合素免疫染色的方法331. 环氧树脂包埋的超薄切片（经1-10%H2O210min）或低温包埋的超薄切片2. 2%NSS, 5min，吸干3. 特异性一抗，4,，24-48hr，PBS洗4. 2%NSS，5min，不吸干5. 羊抗兔球蛋白(1:50-1:100)10min， PBS洗6. 2%NSS ，5min，不吸干7. 兔PAP(

14、1:50-1:100)2-3min， PBS洗8. 加含H2O2的DAB, 3-4min9. Tris-HCl洗10. PBS洗11. 干燥后在透射电镜下观察PAP法包埋后染色34PAP法包埋后染色35 1. 观察单个细胞表面抗原：采用各种方法均可，无需考虑穿透组织的问题；多用ABC法或PAP法。 2. 观察细胞内或组织内抗原：进行包埋前染色需使用穿透剂，选用分子量小的酶标记物（鼠PAP法）。包埋后染色无需使用穿透剂，可选用兔PAP法或ABC法。酶标记免疫电镜注意事项3637 指利用胶体金在碱性环境下带负电荷的性质，使其与抗体相吸引将其标记，然后与未知抗原结合，在电镜下观察胶体金存在的部位，从

15、而确定免疫反应部位的方法。胶体金标免疫电镜技术38优点：胶体金颗粒电子密度高，电镜下清晰可辨。胶体金制备简单，价格便宜；多不出现非特异性吸附和标记；常用覆有火棉胶的镍网进行免疫染色。胶体金液体无毒，对人体无损伤，使用安全。胶体金标记的抗体可加入培养液中对培养细胞内抗原进行标记定位。胶体金标记的特异抗体、包埋后染色多用于细胞表面抗原的检测（因金颗粒对细胞膜的穿透性差）；包埋后染色用途较广，多采用间接法。可用于细胞表面、胞质中细胞器及胞核中特异抗原和抗体的研究，也可用于细胞骨架的研究。胶体金标免疫电镜技术391. 镍网的载网切片2. 1-2%BSA/1:5NSS 10min3. 特异性一抗 ，4

16、，20hr/室温，2hr4. 0.05mol/L TBS 含0.5%TritonX-100洗，30min5. 0.02mol/LTBS含0.1%BSA洗，1min、6. 2%BSA /1:5NSS ，10min7. 胶体金标记二抗，4过夜/室温，2hr8. 0.02mol/LTBS洗，1min9. 0.05mol/LTBS含0.5%TritonX-100洗，30min；双蒸水洗，3次10.铀染色，4-5min；铅染色，2min11.TEM观察胶体金标间接法包埋后染色胶体金标免疫电镜技术40抗体要有高度特异性和亲合力被检组织应有较高浓度的抗原清洗液和器皿清洁度高清洗要彻底孵育要在湿盒内进行，保持

17、载网湿润金标记物在保存中可产生凝集物，故在使用前应稀释后离心800010000rpm/min，2030min，以去除凝集物。胶体金标记免疫染色的注意事项胶体金标免疫电镜技术41胶体金标免疫电镜技术4243 (C) secretory granules, which defines them as autolysosomes. The arrowheads show LAMP-2 labeling on the limiting membrane of the autolysosome, indicating that the secretory granule is enclosed within the autolysosome. (D) Another example of an autolysosome in Gnptab / pancreatic a