生物化学A（上）10-核酸化学1

1、核酸化学Biochemistry of Nucleic Acids核酸是重要的生物大分子-遗传物质核酸研究是现代生物化学及分子生物学的重要领域一百多年的研究历史（1868）核酸的生物学作用在其被发现后的70多年才被证明-所有生物的遗传物质（1944）DNA双螺旋结构（1953）重组DNA技术（1972）人类基因组计划（1990-2003）RNA干扰（RNAi）（1996）核酸的生物学功能主要是遗传的物质基础，随着对核酸研究的深入，发现它的功能是多方面的。生物体的生长发育、遗传变异等都与核酸密切相关。因此核酸结构和功能的研究对深入探索生命奥秘起着至关重要的作用。研究历史核酸化学研究史（1）186

2、9年 Miescher博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时, 发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物, 并在所有细胞的核里都找到了此物质, 故命名“核质(Nuclein) ”。1879年 Kossel经过10年的努力, 搞清楚了核质中有四种不同的组成部分: A、T、 C 和 G。核酸化学研究史（2）1889年 Altman建议将”核质”改名为“核酸”, 认识到“核质” 乃“核酸” 与蛋白质的复合体。1909年 Levene 发现酵母的核酸含有核糖1930年 Levene 发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖脱氧核糖, 得出了一个概念：植物核酸含核糖、动物核酸含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到193

3、8年，这时方清楚RNA和DNA的区别。Levene还提出了核酸的“磷酸核糖(碱基)磷酸”的骨架结构, 解决了DNA分子的线性问题, 并在1935年提出“四核苷酸”说, 认为这四种碱基的含量是一样的。核酸化学研究史（3）1950年 Chargaff, E和Hotchkiss, R. D采用纸层析法仔细分析了DNA的组成成分, 得知A=T, G=C, A+G=C+T1953年 Watson, Crick根据DNA的X射线图谱的研究结果, 提出了DNA的双螺旋模型(Double helix)。几星期后提出了半保留式复制模型。1957年 Meselsnhe & Stahl用密度梯度超离心法和同位素标记

4、-半保留复制假说。核酸化学研究史（4）1958年 Kornberg得到高纯度的 DNA polymerase, 这种酶需要一个模板DNA。1960年 Cairns拍下了复制中的细菌DNA的电镜照片。 1970年 发现第一个DNA限制性内切酶。1972年 DNA重组技术的建立。1978年 双脱氧DNA测序法的建立。1990年 人类基因组计划(HGP)实施。核酸化学研究史-rRNA（5） 早在上世纪30年代后期就发现细胞质和细胞核中都有核酸存在，但用1924年福尔根发明的染色法去染色，只能使细胞核中的核酸染色。而两种核酸在260 nm的吸收非常相似。 1941年，细胞学家J.Brachet和T.C

5、aspersor注意到细胞质中的核酸与蛋白质的合成有密切的关系。 50年代，通过电子显微镜和物理化学手段发现大肠杆菌细胞质的RNA常常存在于蛋白质合成相关的颗粒中（20 nm, 用35S进行脉冲式标记的实验证明该颗粒是蛋白质合成的所在地），简称核糖体(ribosome)。 核糖体得到分离后，发现里面含RNA-rRNA (ribosomal RNA)。Watson等发现，rRNA的GC，AU，推断是单链分子。核酸化学研究史-mRNA （6） 1948年，有人报道当噬菌体感染了细菌后会产生一种很不稳定的RNA，而大多数也是和核糖体结合在一起。 Brenner, Jacob等人用13C，15N标记蛋

6、白质，用32P标记核酸的方法证实了这是一种新的RNA分子，命名为信使RNA, 即mRNA (messenger RNA)。 1961年，Spielman创立了分子杂交法，通过32P -mRNA-DNA杂交分子证明了mRNA的存在。核酸化学研究史-tRNA（7） 1957年Hoagland, M.B.发现一类稳定的RNA小分子，不与核糖体结合，因而不同于mRNA和rRNA。Crick, F.比较了核酸和氨基酸的大小和形状后，认为两者不可能在空间上互补，因此他对核酸蛋白质的信息传递作了以下预测：a). 有一种分子转换器，使信息从核酸序列转换成氨基酸序列；b). 这种分子很可能是核酸；c). 它不论

7、以何种方式进入蛋白质翻译系统的模板，都必须与模板形成氢键（即配对）；d). 有20种分子转换器，每种氨基酸一个；e). 每种氨基酸必定还有一个对应的酶，催化与特定的分子转换器结合。 1963年， Ehrenstein等用实验证明了Hoagland 发现的分子就是Crick预言的分子转换器，即tRNA。 1965年Holley经过7年努力测出酵母Ala-tRNA序列。核酸化学研究史-遗传密码的破译（8）1953年 Dounce假设DNA通过RNA将信息传给蛋白质，RNA上每三个核苷酸形成一个“ 空洞”，正好将一个个氨基酸装进去, 并允许三联体的重叠。命中率801954年 物理学家Gamow与Te

8、ller等人联手，也提出三联体学说，并指出不可重复的特点。 命中率201957年 Crick也提出了三联体的假说。他意识到要解决“ 天书”的“ 词法”和“ 句法”，必须要有一本标准词典，以便决定64种组合中的44种是无用的。 即“ 简并密码”和“ 阅读框”1961年 Crick在Bencer, S的突变实验的基础上，用重组法得到了+和-型，发现读框和野生型一致，从而证明了三联体的假说。1961年 Nirenberg, Matthaei & Ochoa用生物化学手段开始了密码测试，得到20种氨基酸的密码子的核酸成份。1964年 Khorana合成了U和G交替的多聚核苷酸，所对应的合成肽为VCVC

9、VC，对照密码子的核酸成份可以最终决定。后来合成了UUGUUUGUUG产生了poly(L), poly(C)和poly(V)。1964年 Nirenberg找到了更妙的突破口，合成三联体，它能与tNRA进行密码子反密码子的碱基配对，从而影响肽链的合成。1966年 遗传密码的破译工作基本结束，Crick绘制了密码表，提出了摆动学说（wobble concept)，及时收回了“ 同义词”不存在的假设。 James Watson (left) and Francis Crick青山衬托之下，是一片金灿灿的中国水稻梯田。2002年4月5日以中国梯田为封面的 Science杂志以14页篇幅率先发表了一个

10、重大成果中国人独立完成的论文水稻（籼稻）基因组的工作框架序列，显示对中国科学家成就充分肯定。COVER Photograph of the Honghe Hani rice terraces in Yunnan Province, China. In this issue, two separate research groups report draft sequences of two strains of rice-japonica and indica. In addition, the Editorial, News Focus, Letters, and Perspectives

11、highlight the significance of the rice genome to the worlds population. Image: Liwen Ma and Baoxing Qiu, Beijing Genomics Institute核酸骨架结构The backbone structrue of nucleic acids核酸的一级结构：一分子核苷酸的3-位羟基与另一分子核苷酸的5-位磷酸基通过脱水可形成3,5-磷酸二酯键，将两分子核苷酸连接起来。核酸就是由多个核苷酸单位通过3,5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。核酸是有方向性的长链状化合物，多核苷

12、酸链的两端，一端称为5-端，另 一端称为3-端。53核 酸核酸是生物体内的高分子化合物，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。一、元素组成组成核酸的元素有C、H、O、N、P等，与蛋白质比较，其组成上有两个特点：一是核酸一般不含元素S，二是核酸中P元素的含量较多并且恒定，约占9-10%（通常取9.5%）。因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定P含量来代表核酸量。二、化学组成与基本单位核酸经水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本单位。核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。核糖核酸（RNA）：细胞质，

13、参与蛋白质的生物合成 mRNA （信使RNA ），5 %，Pr合成的直接模板 tRNA （转运RNA ）， 15 %，活化与转运AA rRNA （核糖体RNA），80 %，充当装配机，提供蛋白质合成的场所。脱氧核糖核酸（DNA）：核内染色质，遗传的物质基础 基因 DNA分子中的 功能 片段（决定遗传特性） （特定的碱基序列） 核酸的分类、分布与功能核 酸脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）tRNAmRNArRNA蛋白质合成核酸的分类遗传信息两类核酸的分子组成RNADNA组 分磷 酸磷 酸戊 糖核 糖脱氧核糖碱基嘌 呤嘧 啶A GUCTDNA：细胞核(98%）、线粒体、叶绿体RNA：细胞质r

14、RNA：核仁中合成，占总RNA的80%tRNA：核内合成，占总RNA的15%mRNA：核内合成，占总RNA的5%核酸的分布DNA的水解产物中有碱基、磷酸、脱氧核糖、核苷、核苷酸等，因而推测DNA的骨架结构为DNA的骨架结构RNA分子与DNA分子的区别只在一个核糖羟基，T vs U， 但就这点区别，RNA分子的化学性质比DNA活泼得多。RNA的骨架结构碱基结构Structure of Bases 嘌呤 腺嘌呤（A）（6-氨基嘌呤） 鸟嘌呤（G）（2-氨基-6-氧嘌呤）Purines嘧啶环+咪唑环甘氨当中站谷氮坐两边左上天冬氨 头顶CO2 自然界许多生物碱是嘌呤的衍生物： 尿酸(uric acid

15、)：2, 6, 8-三羟嘌呤，嘌呤代谢产物 黄嘌呤(xanthine)：2, 6-二羟嘌呤，嘌呤代谢产物 次黄嘌呤(hypoxanthine)：6-羟基嘌呤，嘌呤代谢产物 茶叶碱(theophylline)：1, 3-二甲基黄嘌呤 可可碱(theobromine)：3,7 -二甲基黄嘌吟 咖啡碱（咖啡因）(caffeine)：1, 3, 7-三甲基黄嘌呤 玉米素(zeatin)：N6-异戊烯腺嘌呤激动素(kinetin)：N6-呋喃甲基腺嘌呤 Pyrimidines嘧啶 胞嘧啶（C）（2-氧 4-氨基嘧啶） 尿嘧啶（U） （2，4-二氧嘧啶） 胸腺嘧啶（T）（5-甲基尿嘧啶）Asp氨甲酰磷酸（

16、Gln+CO2） 胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性-主要是环内氨基的贡献鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上核苷和核苷酸Nucleosides and Nucleotides核苷 = 碱基 + 戊糖 （nucleoside, Ns)糖苷键，嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的N-1与糖的C-1以N-C糖苷键相连。腺嘌呤核苷（腺苷）胞嘧啶脱氧核苷（脱氧胞苷） or ？ Anti- or syn-?Join base to pentoseGlycosidic bond -anomerWater soluble腺苷(AR) 脱氧胞苷(dCR) 1,N

17、9-糖苷键 1,N1-糖苷键 RibonucleosidesDeoxyribonucleosidesCH3Nucleoside ConformationsAnti- or syn- conformationsBase and pentose rings roughly perpendicular “稀有核苷”是由“稀有碱基”所生成的核苷： 假尿苷（） 1,C5-糖苷键 核苷酸 = 核苷 + 磷酸 （nucleotide, Nt)连接方式：磷酸酯键，糖环上所有游离羟基（核糖的C-2、 C-3、C-5及脱氧核糖的C-3、C-5 ）均能与磷酸发生酯化结合。生物体内多数核苷酸是5-核苷酸，即糖环上的C

18、-5 与磷酸酯化。腺嘌呤核苷酸（腺苷酸）脱氧胞嘧啶核苷酸（脱氧胞苷酸）名称与缩写(1)RNA：ribonucleic acid 核糖核酸DNA：deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸pyrimidine： cytosine (Cyt) 胞嘧啶 嘧啶 thymine (Thy) 胸腺嘧啶 uracil (Ura) 尿嘧啶purine： adenine (Ade) 腺嘌呤 嘌呤 guanine (Gua) 鸟嘌呤 名称与缩写(2)Ribonucleoside (Ns) 核糖核苷 （不带磷酸） adenosine (Ado) 腺(嘌呤核)苷 guanosine (Guo) 鸟(嘌呤

19、核)苷 cytidine (Cyd) 胞(嘧啶核)苷 thymidine (Thd) 胸(腺嘧啶脱氧核)苷 uridine (Urd) 尿(嘧啶核)苷Ribonucleotide (Nt) 核糖核苷酸 （带磷酸） adenosine 5- mono (di, tri) phosphaste； AMP, ADP, ATPdeoxyribonucleoside 脱氧核糖核苷（不带磷酸） deoxyadenosine (dAdo) deoxyribonucleotide 脱氧核糖核苷酸（带磷酸） dAMP, dADP, dATPdNTPDNA中的四种碱基及它们间的氢键胞嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤TCA

20、GCH3Ura与DNA分子中的Thy的区别RNA分子中的四个碱基核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离核苷酸的解离磷酸基使核苷酸具有很强的酸性DNA等电点为4-4.5RNA等电点为2-2.5碱基、核苷、核苷酸的值碱基 adenine 4.15, 9.8 cytosine 4.5, 12.2 guanine 3.2, 9.6 thymine 9.9, 13核苷 adenosine 3.5, 12.5 deoxyadenosine 3.8 cytidine 4.15, 12.5 deoxycytidine 4.3, 13 guanosine 1.6, 9.2 deoxyguan

21、osine 2.5 uridine 9.2, 12.5 deoxythymidine 9.8, 13核苷酸 AMP 3.7, 6.1 : dAMP 4.4 ADP 3.9, 6.3 : - CMP 4.5, 6.3 : dCMP 4.6 GMP 2.4, 6.1, 9.4 : dGMP 2.9, 9.7 UMP 6.4, 9.5 : dTMP 10.0核苷酸酸的紫外吸收 碱基中含有共轭双键最大吸收峰260 nm左右核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。：摩尔吸光系数A：吸收值 W：每升溶液磷重量L ：比色杯内径由于共振作用，所有核苷酸的碱基都吸收紫外光，核酸在260

22、nm附近有强大光吸收。OD260的应用：1. DNA或RNA的定量OD260= 1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2. 判断核酸样品的纯度DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0含杂蛋白及苯酚，降低DNA与RNA互混？3. 判断DNA是否变性修饰碱基（核苷）Modified bases (nucleosides)DNA中的稀有碱基。5-甲基胞嘧啶存在与动物和高等植物DNA中，N6-甲基腺嘌呤存在于细菌DNA中，5-羟甲基胞嘧啶存在于噬菌体感染的细菌DNA中。tRNA中的稀有碱基。All

23、 of the four bases in tRNA can be modified与氨基酸一样，碱基在细胞中也受到各种各样的修饰，其产物常常扮演信号传导信使分子、营养因子、辅酶等角色，并对核酸结构的稳定性起着重要作用胸腺嘧啶核糖核苷二氢尿苷假尿苷4-硫尿苷3-甲基胞苷次黄苷，肌苷喹啉（Q核苷）7-甲基鸟苷W(Y）核苷体内一些重要核苷酸能量物质： ATP、GTP、UTP、CTP等；酶辅助因子：NAD+、 NADP + 和FAD 等；信号传导： 环腺苷酸（ cAMP），环鸟苷酸（cGMP）;重要代谢中间物：PAPS（3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸）、SAM（S-腺苷甲硫氨酸）、UDPG（鸟苷二磷酸葡

24、萄糖）、UDPGA（鸟苷二磷酸葡萄糖醛酸）、CDP-胆碱（乙醇胺）等 AMPADPATP3 ,5 -cAMPcAMP(3,5- 环腺嘌呤核苷一磷酸)和 cGMP( 3,5-环鸟嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作为细胞之间传递信息的信使。cAMP 和 cGMP 的环状磷酯键是一个高能键。在 pH 7.4 条件下, cAMP 和 cGMP 的水解能约为43.9 kj /mol，比 ATP 水解能高得多。核酸的物理性质 I1、性状：RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。2、粘性：核酸的水溶液粘度很大，DNA溶液的粘度大于RNA。核酸变

25、性后，粘度下降。核酸的物理性质 II3、溶解性：RNA和DNA都是极性化合物，一般都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。细胞内DNA和RNA都与蛋白质结合成核蛋白。DNA核蛋白与RNA核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。DNA核蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1 mol/LNaCl溶液中的溶解度比纯水的高2倍，在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解；而RNA核蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14 mol/L的NaCl中溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常依此将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去

26、除蛋白质。核酸的水解酸或碱水解RNA的碱水解DNA和RNA的共价主链可以被非酶条件缓慢水解磷酸二酯键，试管中RNA可被碱性条件迅速水解，而DNA则不。RNA的C-2羟基直接参与了水解过程，2, 3-单磷酸是碱对RNA作用的第一个产物，后者进一步迅速被水解生成2-及3-核苷单磷酸。碱性条件下RNA的水解RNase酶水解核酸水解酶两种酶水解方式及产物a形式及b形式的两种磷酸二酯酶外切核酸酶-逐个水解胰核糖核酸酶（RNase）：内切酶，以b方式水解，产物为以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸(Palindrome)粘性末端末端为含未配对碱基，能与具有互补碱基的目的基因片段的DNA连结，故称为粘性末端。这种

27、酶在基因工程中应用最多。平头末端在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无粘性末端的平口.核酸的一级结构核酸中的核苷酸依此以磷酸二酯键连接。核酸的一级结构是指核酸的核苷酸组成、排列顺序及连接方式。DNA分子主要由dAMP、dGMP、dCMP和dTMP四种脱氧核糖核苷酸所组成。DNA的一级结构就是指DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。RNA分子主要由AMP、GMP、CMP、UMP四种核糖核苷酸组成。RNA的一级结构是指RNA分子中核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。核酸一级结构的表示方法 5-AGTCCATG-3 AGTCCATG GTACCTGA 5-AGUCCAUG-3 AGUCC

28、AUG GUACCUGApA-C-G-T-AOHpApCpGpTpApACGTADNA的二级结构-双螺旋结构DNA双螺旋结构的研究背景1950-1953，Chargaff研究小组对DNA的化学组成进行了研究，发现： DNA碱基组成有物种差异，且物种亲缘关系越远，差异越大； 相同物种，不同组织器官中DNA碱基组成相同，而且不因年龄、环境及营养而改变； DNA分子中四种碱基的摩尔百分比具有一定的规律性，即A=T、G=C、A+G=T+C。这一规律被称为Chargaff法则。Chargaffs rulesG=CA=T双螺旋结构的主要依据（1）Wilkins和Franklin发现不同来源的DNA纤维具有

29、相似的X射线衍射图谱。1953年由Wilkins研究小组完成的研究工作，发现了DNA晶体的X线衍射图谱中存在两种周期性反射，并证明DNA是一种螺旋构象。 （2）Chargaff发现DNA中A与T、C与G的数目相等。后Pauling 和Corey发现A与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。（3）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。Watson和Crick定义的核酸中碱基对的氢键模式DNA中的四种碱基及它们间的氢键胞嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤TCAG碱基间的氢键可以有不同形式Watson-CrickHoogsteen碱基配对时碱基一般以酮式存在，而不是醇烯式；碱基中的H原子一般不移动，因

30、此很少有亚氨基团；在中性pH条件下，参与氢键的-NH2基均不带电荷，这是杂环电子共轭以及氢键的共同作用的结果，否则双螺旋结构不会稳定。（约1 %）B型双螺旋DNA的结构特点：(1) DNA由2条反向平行的多核苷酸链构成的右手平行双螺旋。有大沟、小沟。(2) 主链位于螺旋外侧，碱基位于内侧； (3) 两条链间存在碱基互补：A与T或G与C配对形成氢键，称为碱基互补原则（A与T为两个氢键，G与C为三个氢键）； (4) 螺旋的稳定因素为氢键和碱基堆砌力； (5) 螺旋的螺距为3.4 nm，直径为2 nm，相邻碱基对平面距离0.34 nm，相差36度，10个核苷酸/圈。(6) 有共同的螺旋轴，碱基朝内，

31、氢键相连与轴垂直，戊糖平面与螺旋轴平行，与碱面垂直。Watson-Crick的DNA双螺旋2.0 nm结构特征1953 James Watson and Francis Crick solve the structure of DNA双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直稳定双螺旋结构的作用力为氢键和碱基堆积力（即疏水作用）Twist 36大沟和小沟： 大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间,而大沟位于相毗邻的双股之间。这是由于连接于两条主链糖基上的配对碱基并非直接相对, 从而使得在主链间沿螺旋形成空隙不等的大沟和小沟。 在大沟和小沟内的碱基对中的N 和O 原子朝向分子表面。 碱基的配对使得双螺旋DNA分子在复制时以半保留的形式进行。Messelson 和 Stahl 的实验大肠杆菌DNA的复制电镜照片同位素标记（红色）DNA双螺旋的构象类型B-DNA：92%相对湿度，接近细胞内的DNA构象，与Watson 和Crick提出的模型相似。A-DNA：7