分子生物学检验：线粒体疾病的分子生物学检验

1、线粒体疾病的分子生物学检验线粒体（mitochondrion）线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的由两层膜包被的细胞器，直径在0.5-10m结构：外膜：平滑，脂类/蛋白=50%/50%嵴：内膜内折，扩大内膜面积，提高氧化磷酸化酶附着面积和局部浓度和排序内膜 ：脂类/蛋白=20%/80%基质：基质颗粒，包含三羧酸循环的酶功能：三羧酸循环氧化磷酸化一、线粒体基因组与疾病线粒体有半自主的DNA复制（mtDNA）、转录和蛋白质的翻译系统mtDNA较小，16,569 bp基因结构及排序简单，无内含子，非编码序列少，同一个体为单倍体每个细胞内有数百个至几千个拷贝（一）、线粒体基因组及其表达系统人类线粒体基

2、因组DNA，闭合环状双链分子编码区，37个基因：13个蛋白多肽、22个 tRNA基因2个 rRNA基因6%非编码区（一）、线粒体基因组结构基因：细胞色素b基因，细胞色素氧化酶3个亚基，NADH氧化还原酶7个亚基，ATPase 2亚基，共13个，构成线粒体内膜呼吸链的重要成分。tRNA基因：共22种，转录20种tRNA（tRNALeu和tRNASer都有两个基因）rRNA基因：12S rRNA和16S rRNA非编码区：D-Loop和L链复制起始区密码子：AUA-起始密码子，UGA-Trp, AGA、AGG-终止密码子复制：半保留非同步复制,重链逆时针、轻链顺时针方向复制转录：对称，tRNA处剪

3、切，mRNA 3 polyA 尾巴，无5 帽子蛋白质合成：13个蛋白多肽在线粒体合成，其他的蛋白合成的起始因子、延伸因子、释放因子以及核糖体蛋白质在胞浆合成（一）、线粒体基因表达系统（二）、线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系mtDNA与nDNA关系：位置独立，密切联系交叉对话机制：核呼吸因子-1/2（NRF-1/2）作用于mtDNA和nDNA,调节呼吸链亚基的合成，影响氧化磷酸化激素、生长因子或外部刺激作用于mtDNA和nDNA（三）、线粒体基因组变异与疾病mtDNA无组蛋白，易积累损伤并变异mtDNA变异同质性变异：细胞内所有的mtDNA发生同样的变异异质性变异：细胞内仅一部分的mtDNA

4、发生某一变异，程度与疾病的发病及病情的严重程度相关线粒体基因组的变异数量 变异：mtDNA的拷贝数变异结构变异：mtDNA的碱基突变、插入和缺失等（三）、线粒体基因组变异与疾病碱基突变点突变：降低线粒体内蛋白质的合成能力，从而影响线粒体的氧化磷酸化，导致疾病的发生。Leber遗传型视神经病：ND1基因中的G3460A，ND4基因中的G11778A缺失与插入缺失： mtDNA的异常重组，常发生于神经性疾病及一些退化疾病，如KSS综合征插入：较少见mtDNA拷贝数目突变拷贝数大大低于正常，较少见二、线粒体基因组与耳聋mtDNA突变是导致耳聋发生的重要原因之一12S rRNA基因的A1555G和C1

5、494T突变: 是氨基糖甘类抗生素耳毒性的主要分子致病基础tRNASer(UCN)T7511C:非综合征型耳聋tRNALeu(UUR)A3243G:综合征型耳聋继发突变对原发突变起协同作用（一）、与耳聋相关的mtDNA突变PCR-RFLP技术限制性内切酶如Alw26 I、Apa I和Xba等来检测mtDNA A1555G、A3243G和A7445G突变DHPLC技术DNA测序技术基因芯片技术（二）、耳聋相关的mtDNA突变的检测三、线粒体与Leber遗传性视神经病变Leber遗传性视神经病变(LHON)是一种主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经变性的母系遗传病。mtDNA突

6、变是LHON发病的分子基础。ND1 G3460A、ND4 G11778A、ND6 T14484C等三个最主要的原发突变tRNAMet A4435G、 tRNAThr A15951G等继发突变与原发突变起协同作用(一)与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变PCR-RFLP技术DHPLC技术DNA测序技术基因芯片技术（二）、LHON相关的mtDNA突变的检测四、线粒体与糖尿病1992年van den Ouweland等首次发现1个糖尿病家系有mtDNA tRNALeu(UUR) A3243G,1999年WHO将线粒体归为特殊糖尿病中的一种，目前已经发现有几十个突变位点，但tRNALeu(

7、UUR) A3243G仍是目前国际公认的线粒体糖尿病致病突变点(一) mtDNA突变与糖尿病PCR-RFLP技术DHPLC技术DNA测序技术（二）、线粒体糖尿病的检测tRNALeu(UUR) A3243GPCR-RFLP技术基于PCR技术。DNA碱基突变正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失。PCR扩增包含碱基突变的DNA，限制酶切，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，与正常比较来确定是否变异。基本流程1.查询序列，设计引物2.提取DNA3.PCR扩增4.产物酶切，凝胶电泳DHPLC技术变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid ch

8、romatography，DHPLC）原理：在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。DNA测序技术Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。Sanger sequencing(gol

9、d standard)ROCHE454二代测序PCRSequence 400-600 million high-quality, filter-passed bases per run, 15 gene*20 exon*100 patients=30,000 PCR(well)30,000 *250 base=7.5*106 baseROCHE 454BRCA1BRCA2Chk2ATMPALB2.Genes on the chip:BRCA1 (introns included)BRCA2 (introns included)ATM CDH1AURAKA CHEK2BAP1 COBRA1BAR

10、D1 MRE11ABRCC3 NBNBRIP1 PALB2RAD50 NRIP1FGFR2 BRAPSTK11DNA capture protocol.1. Fragment patients DNA2. Hybridize to chip with genes of interest3. Sequence on GS-FLXPyrosequencing基因芯片技术其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。Ann. Med. 44, 4159.Mitochondrial diseases are among the most common of the inherited disorders of metabolism, The minimum prevalence is at least 1 in 5000, and could be much higher.Function of mitochondriaATP-oxidative phosphorylationheme biosynthesissteroid hormone biosynthe