分子生物学检验：真核细胞RNA提取及RT-PCR

1、真核细胞RNA提取及RT-PCR2015.06.10一、人骨髓细胞总RNA的提取（Trizol法提取）目的：1.掌握人骨髓细胞中总RNA提取的基本原理2.熟悉Trizol法提取总RNA的原理和操作原理:Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，再加入氯仿后形成两相，DNA与蛋白质存在于有机相，RNA保留于上层水相，将上层水样收集后，通过异丙醇沉淀即可得到RNA。Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总RNA器材与试剂：EP管、加样枪、离心机、振荡器、Trizol Reagent 、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC(二乙基焦炭酸盐)水标本：人骨髓液操作

2、步骤：1取骨髓液标本0.4ml，加0.8ml的Trizol，充分吹打混匀2.各层相分离：室温静置5分钟，12000转/分，4离心10分钟，将上清液转移到另外一个EP管中3加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀30s，静置3分钟，12000转/分，4，离心10分钟，离心后分三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相（RNA主要在水相中）和一个中间层。 4将上清液小心转移到1.5ml离心管里，加入600ul异丙醇吹打混匀，室温下放置10min，12,000转，4 离心10 min。【注意：不要吸取任何中间层物质，否则会出现Genomic DNA污染】5.小心移去上清液，防止沉淀丢失 6.用75%酒精（用DE

3、PC水配置）洗涤，每次1ml，12000转/分，4，离心5分钟 7.尽可能彻底地吸走上清，同时防止丢失RNA沉淀8.室温下干燥3-5分钟使酒精充分挥发，加20ul DEPC-H2O溶解，置冰上备用。 思考题：1.哪些原因可导致RNA被降解？2.如RNA得率比较低，最可能出现的原因是什么？二、 RNA的琼脂糖电泳【试剂准备】 所提取人骨髓细胞总RNA 10Loading Buffer Goldview琼脂糖TBE缓冲液操作步骤：1、用电子分析天平称取1.5g的琼脂糖放入三角烧瓶2、将5TBE用去离子水稀释到0.5TBE工作液3、用100ml量筒量取100ml 0.5TBE到三角烧瓶中4、将三角烧

4、瓶的口用厚纸包严以防止挥发5、将三角烧瓶放在微波炉中加热34分钟到完全融化6、将三角烧瓶放置于室温冷却到不烫手7、加入Goldview(EB替代品) 5L摇匀，倒入制胶模具中8、等琼脂糖完全凝固后拔去梳子，连塑料托底一起放入电泳槽中9、取10L所提取的人骨髓细胞总RNA，用2L10Loading Buffer混合后加入胶孔中10、120V,电泳30min，用凝胶成像仪器成像二、RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）目的：1.掌握RT-PCR的基本原理；2.熟悉RT-PCR的反应体系、操作及电泳分析原理：提取组织或细胞中的RNA，采用oligo(DT)或随机引物，利用反转录酶反转录成CDNA，然后以

5、CDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因的表达。试剂：PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（一步法试剂盒）器材：凝胶电泳仪、PCR仪、凝胶成像仪、离心机、移液管、0.5TBE、Goldview、DL2000 Marker、灭菌双蒸水标本：人骨髓液1.RT-PCR反应体系试剂用量终浓度PrimeScript 1 step Enzyme Mix2ul2x1 step Buffer25ul上游primer（20uM）1ul0.4uM下游primer（20uM）1ul0.4uMTemplate RNA5ulRNase Free dH2O16ul2.RT-PCR反应条件第一步：50C 30min第二步：94C 2min第三步：94C 30s 第四步：60C 30s第五步：7