分子生物学检验技术：第四、五章 核酸序列分析、生物芯片技术

1、1第四章 核酸序列分析 2DNA测序技术是分子生物学基本技术之一。测定并分析核酸的序列，是研究其结构、功能及其相互关系的前提，是分子生物学最基本的课题，并为临床疾病的分子诊断提供最为精确的判定依据。3本章内容1、第一代DNA测序技术2、第二代测序技术3、第三代测序技术的发展趋势41、第一代DNA测序技术1977年Sanger等发明的双脱氧链末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。51）双脱氧链末端终止法测序原理生物化学（第3版）图1 DNA合成原理图6DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3-OH末端上进行的。由于2，3-双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）的3-位脱

2、氧而失去游离-OH，当它掺入到DNA链后，3-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。7利用DNA聚合酶，以单链DNA为模板，以4种dNTP为底物，在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA的序列。8图2 双脱氧链末端终止法测序原理19图3 双脱氧链末端终止法测序原理2102）测序体系待测模板（单链或双链DNA） 测序引物DNA聚合酶（Klenow片段 、测序酶 、Taq DNA聚合酶）dNTP和ddNT

3、P荧光标记 DNA片段的凝胶电泳 113）方法特点该法测定的序列是酶促反应生成的产物，其准确性可能受碱基错误掺入的影响，并且难以分析有碱基修饰和存在二级结构的DNA样品。一次反应可测500个以上的碱基序列；具有方法简便快速，便于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNA样品序列分析的需要等特点，在DNA序列分析中得到最广泛的应用。124）自动化测序以全自动化操作系统代替传统的手工操作，以荧光染料标记代替传统的放射性核素标记，以PCR循环测序反应为主导方法代替传统的酶反应方法，以集束化的毛细管电泳代替传统的凝胶电泳，以高速自动化的序列分析系统代替传统的人工识读等。具有简单、安全、精确、并行和高效等特

4、点。13自动化测序系统基于单一荧光染料标记的自动化测序系统基于多种荧光染料标记的自动化测序系统14基于单一荧光染料标记的自动化测序系统15基于多种荧光染料标记的自动化测序系统162、第二代测序技术尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。1）第2代测序技术的原理建立文库产生DNA簇测序（1）Roche公司的454测序技术待测DN

5、A文库的构建：把待测序列用喷雾法打断成300-800bp的小片段，构建单链DNA(ssDNA)文库。EmulsionPCR：将ssDNA与水油包被的磁珠一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增,扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。1819测序：焦磷酸测序技术测序引物与单链DNA模板退火后，通过DNA聚合酶、ATP硫酸化

6、酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等四种酶的级联反应，将每一个dNTP的掺入与一次荧光信号的释放偶联起来，以荧光信号的形式实时记录DNA模板的核苷酸序列。20分子诊断学（第2版） 图5 焦磷酸测序技术原理 21Pyrosequencing 图1. 454测序技术流程454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物(homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得

7、后继的序列拼接工作更加高效、准确。（2）Illumina公司的Solexa技术待测DNA文库的构建把待测序列打断成200-500bp的小片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建ssDNA文库。BridgePCR：DNA与流动槽的附着将这些ssDNA随机地附着在流动槽表面的channel上。流动槽是一种含有8个channel的微纤维板，它的表面固定有很多接头，能支持ssDNA在其表面以固定的接头为模板进行桥式扩增。24测序：边合成边测序（SBS）向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。由于这些dNTP的3羟基被化学方法保护，因而每轮合成反应都只能

8、添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱。加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光信号的记录，再通过计算机分析转化为测序结果。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College25图2. Solexa测序技术流程Solexa技术的读取长度可以达到275bp，相比454技术，其后续的序列拼接工作的计算量和难度均大大增加。 Solexa技术主要的错误来源是核苷酸的替换，而不是插入或缺失，目前它的错误率大约在1-1.5 %之间。Solexa技术每个循环能获得20.5

9、-25 Gb的测序结果，耗时约9.5天。Solexa技术在合成中每次只能添加一个dNTP，因此很好地解决了同聚物长度的准确测量问题。3）ABI公司的SOLiD技术待测DNA文库的构建把待测序列打断成很小的片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建ssDNA文库。EmulsionPCR与454技术的EmulsionPCR类似，将带接头的ssDNA固定在磁珠表面，进行PCR扩增，并对扩增产物进行3端修饰。28测序：连接酶测序向体系中加入DNA连接酶、通用测序引物n和具有3-XXnnnzzz-5结构的八聚核苷酸。在这个八聚核苷酸中，第1和第2位（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在第6

10、-8位（zzz）上加了不同的荧光标记。这种由两个碱基决定的测序方法被称为两碱基测序。当八聚核苷酸由于第1和第2位配对而被连接酶连接上时，会发出荧光。在记录下荧光信息后，通过化学方法在第5和第6位之间进行切割，淬灭荧光信号，以进行下个位置的测序。通过这种方法，每次测序的位置都相差五位，即第一次测第1和第2位，第二次测第6和第7位在测到末尾后，将新合成的链变性、洗脱。而后用通用测序引物n-1进行第二轮测序。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College29通用测序引物n-1与通用测序引物n的差别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基，

11、即通用测序引物n-1在通用测序引物n配对位置上向3端移动了一个碱基。因此在加入DNA连接酶和八聚核苷酸后，可以测定第0和第1位、第5和第6位第二轮测序完成后，接下来再分别加入通用测序引物n-2、通用测序引物n-3、通用测序引物n-4进行第三轮、第四轮、第五轮测序，最终可以完成全部位置的测定，并且每个位置均被测定了两次。School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College30图3. SOLiD测序技术流程SOLiD技术与Solexa技术类似，后续的序列拼接工作也比较复杂。SOLiD技术每个循环的数据产出量为10-15 Gb，耗时约为6-7天

12、。SOLiD技术每个循环可以测两个上样玻片，读取长度可达250bp，而且由于采用两碱基测序，该技术的准确率能达到99.94 %以上。2）第2代测序技术的特点速度快准确度高成本低覆盖度深产出巨大3）第2代测序技术的应用高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。 依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照一个参比基因组(reference genome)高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence) 。2007年Van Orsouw等人结合改进的AFLP 技术和454 测序技术对玉米基因组进行了重测序，所发现的超过75%的SNP位点能够用SN

13、PWave技术验证，提供了一条对复杂基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性分析的技术路线。2008年Hillier对线虫CB4858 品系进行Solexa重测序，寻找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增。 2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了RNA 深度测序。分析测得的序列，有大于90%的数据显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式、3端非翻译区、变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体。而这些信息无论使用芯片技术还是SAGE文库测序都是无法被发现的。高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱

14、，microRNA表达谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA。在线虫中获得了40 万个序列，通过分析发现了18个新的小RNA分子和一类全新的小分子RNA。3）第三代测序技术：单分子测序将单链DNA片段所有碱基均进行标记，A、T、C、G

15、分别标上不同的荧光基团，标记好的单链DNA分子吸附在微球体上并置于液流系统中，然后用核酸外切酶逐个快速切断DNA中标记的核苷酸，液流系统载着切下的核苷酸依次通过检测器，收集分析荧光信号，便可直接得到DNA序列。3839通过一种电子检测器，探测单链DNA分子通过纳米微孔时，轻微的电流变化（不同的碱基产生不同的电流），从而迅速确定长链DNA的序列。41第五章 生物芯片技术42生物芯片技术是指通过微加工和微电子技术，在固相基质表面集成了成千上万密集排列的分子微阵列，以实现对组织、细胞、核酸、蛋白质及其他生物分子进行高效、准确、高通量检测的技术。生物芯片（biochip）包括基因芯片、蛋白质芯片和组织

16、芯片等。43一、基因芯片基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray)。将大量的DNA片段(寡核苷酸、cDNA或基因组DNA片段)有序地、高密度地固定排列在载体(玻璃片、硅片或纤维膜等)上制成点阵，称之为基因芯片。 44基因芯片的原理基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种 高效、快速的 核酸序列分析手段。 45基因芯片发展历史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray46图1 生物芯片分析步骤芯片设计芯片制作PCR扩增靶基因标记原位合成点样方法实际应用样品处理芯片杂交数据分析信号

17、检测放射显影光化学电化学酶促反应47（一）芯片微阵列制备基因芯片的核心技术是如何在一个有限的固相载体表面固定大量的探针阵列。481、载体 玻片 固体片状 硅片 瓷片 硝酸纤维素膜 膜性材料 尼龙膜 聚丙烯膜 49载体材料表面不具备活性基团，需经活化后才能用于在载体上合成探针和固定已经合成的寡核苷酸探针。载体表面的活化主要是涂布多聚赖氨酸或者包被氨基硅烷偶联试剂，使载体表面带有羟基或者氨基等活性基团。502、探针在载体表面的固定 光去保护并行合成法原位合成 分子印章原位合成法 喷印合成法（压电打印法） 合成点样：通过特定的高速点样机器人直接将探针点在芯片上的技术。 51A、原位合成基因芯片的原位

18、合成法是基于组合化学的合成原理。它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序，如要合成AGCT四种碱基所有序列组合的四聚体(256种)，其基本构成可以见下图。 基因芯片原位合成原理示意图 图2 原位合成原理图分子诊断学（第2版） 53B、合成点样 由具有多个微细加样孔的阵列复制器或阵列器及由电脑控制的机器人来完成。机器人准确、快速地将不同探针样品定量(0.251.0l)点样于预处理好的基板相应位置上，在基板上产生直径为100150m斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。 54（二）样品的制备及标记样品的制备：提取、纯化，也可对样品进行适当程度的扩增，以提高阅读灵

19、敏度。 待测样品的标记：大多采用Cy3、Cy5进行单色或双色荧光标记，对于阵列密度较小的基因芯片可以用同位素（如33P）标记。55（三）样品与基因芯片的杂交 cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与常规的分子杂交过程基本相同，相当于一种反相斑点杂交。用于检测基因表达，需要在低温、高盐浓度下进行较长时间的反应 。用于突变检测，需要在高温、低盐浓度下进行较短时间的反应 。 56（四）杂交结果的检测及分析 检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等，使用最广泛的是荧光显影法。 荧光检测器主要有激光共聚焦显微扫描系统和高性能的电荷偶联照相机(CCD) 。57芯片激光光源电子束分裂器聚焦小孔检测器滤光镜聚光镜物镜图5 荧光显影法5859基因芯片的数据分析基因芯片的数据分析，就是把原始数据按一定标准精简、归类，然后从归类数据中寻找有实际生物学意义的过程。合理选择数据分析方法，是充分发挥基因芯片功能的必要条件。60芯片数据分析的步骤 标准化，也称归一化，用来消除不同芯片、不同标记物之间的差异；数据精简，在大量的芯片数据中去掉那些不能