售前备考microrna2014秋季讲座济南

1、microRNA研究新思路- microRNA与三大热点领域的联合应用 2014康成生物KANGCHENExcellence for Research基因表达的调控： hnRNAmRNA mRNA蛋白质失活mRNADNA细胞核细胞质LncRNAmiRNAcircRNA讲座内容 microRNA 历史的简单回顾和现况介绍 microRNA的biomarker研究 microRNA和mRNA的联合研究 microRNA和lncRNA的联合研究 microRNA和DNA甲基化的联合研究 康成生物研究平台，实验服务和数据分析康成生物技术服务历史，发展和前景20062008200920102013201

2、4microRNA mRNA康成生物KANGCHENExcellence for ResearchExosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity. Jianhua Li， et al., NATURE IMMUNOLOGY 2013 (IF 26.008)Overexpression of miR-125b, a novel regulator of innate immunity, in eosinophilic chronic rhinosinusitis with nas

3、al polyps. Am J Respir Crit Care Med, 2012 (IF: 11.08)Signature microRNA Expression Profile of Essential Hypertension and Its Novel Link to Human Cytomegalovirus Infection. Li S., et al., Circulation, 2011 (IF 14.73)MiR-218 Inhibits Invasion and Metastasis of Gastric Cancer by Targeting the Robo1 Re

4、ceptorJun Tie., Yanglin Pan., et al. PLoS Genetics, 2010 (IF 8.69)Repression of the miR-17-92 cluster by p53 has an important function in hypoxia-induced apoptosis Hong-li Yan, Geng Xue, et al. The EMBO Journal, 2009 (IF 9.2)MicroRNA expression and regulation in mouse uterus during embryo implantati

5、on. Hu SJ, Ren G, Liu JL, et al. J Biol Chem., 2008 (IF 4.78)The muscle-specific microRNA miR-1 regulates cardiacarrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2 Baofeng Yang, Huixian Lin, Jiening Xiao, et al. NATURE MEDICINE, 2007 (IF 22.46)康成生物 microRNA 高通量技术服务 since 2006发表的SCI论文已超过70篇(平均IF5.5

6、)More papers please refer to 康成生物技术服务历史，发展和前景200620082009201020132014microRNA lncRNA circRNA DNA甲基化 组蛋白修饰 DNA羟甲基化 TF结合 piRNA mRNA康成技术服务发表文章列表microRNA平台和mRNA平台同时使用：Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity. NATURE IMMUNOLOGY 2013 (IF: 26.008) lncRNA平台：A Long N

7、oncoding RNA Activated by TGF-b Promotes the Invasion-Metastasis Cascade in Hepatocellular Carcinoma. Cancer Cell, 2014(IF: 24.755)MeDIP平台：Exome sequencing identifies somatic mutation of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute monocytic leukemia. Nat. Genet, 2011(IF: 35.53) ChIP平台：CRL4B Catalyzes

8、 H2AK119 Monoubiquitination andCoordinates with PRC2 to Promote Tumorigenesis. Cancer Cell, 2012. (IF: 24.755)microRNA基础小分子RNA，大小约 22 nt miRBase 21.0, 2500个人的microRNAmicroRNA通过种子序列（seed region）与靶 mRNA的MRE（microRNA反应原件）结合，抑制翻译或者降解mRNA 调控至少1/3的人类基因miRNA是临床非常重要的biomarker；尤其在体液中的miRNA表达差异是重要研究目标讲座内容 mic

9、roRNA 历史的简单回顾和现况介绍 microRNA的biomarker研究 microRNA和mRNA的联合研究 microRNA和lncRNA的联合研究 microRNA和DNA甲基化的联合研究 康成生物研究平台，实验服务和数据分析microRNA功能研究经典思路 - microRNA和靶基因（mRNA）Nature Reviews Clinical Oncology 10, 643655 (2013)microRNA功能（细胞/组织水平）microRNA表达变化与随之而来的表型变化调控机制（分子水平）癌microRNA 抑制肿瘤抑制基因调控机制（分子水平）肿瘤抑制microRNA抑制癌

10、基因microRNA作用机制研究：验证靶基因: 报告基因实验一次验证一个靶基因Journal of Hepatology 2011 miR-135a 靶基因 - MTSS1 microRNA靶基因预测 报告基因实验验证靶基因microRNA芯片实验由康成提供技术服务( IF:10.401)Huang and He (2011)难点：报告基因实验，一次只能验证一个靶基因一个microRNA可能有很多个靶基因，每一个都要一次单独的实验验证难点：报告基因实验，一次只能验证一个靶基因miRNAs and target mRNAs in lung cancermiRNAs and target mRNA

11、s in colorectal cancermiR-126，在疾病不同阶段，或不同肿瘤中，有不同的靶基因；每一个都要单独验证microRNA靶基因确定的难点：miRNA靶基因预测网站：TargetScan，miRanda，mirwalk，microRNA作用机制的重新思考：降解mRNA是主要的Lowered mRNA levels account for most (84%) of the decreased protein production mediated by miRNA regulation. These results show that changes in mRNA leve

12、ls closely reflect the impact of miRNAs on gene expression and indicate that destabilization of target mRNAs is the predominant reason for reduced protein output.Mammalian miRNAs exert functional roles mainly through mRNA cleavage !降解mRNA是microRNA调控靶基因的重要方式；可以通过表达谱芯片（RNA水平）来快速，高通量的筛选microRNA的靶基因micr

13、oRNA芯片和表达谱芯片联合应用研究microRNA功能的思路实验组 (n=6）Vs 对照组（n=6） 差异表达的microRNA和mRNA microRNA靶基因预测 microRNA和mRNA的表达相关性分析筛选microRNA-mRNA后续功能研究microRNA芯片表达谱芯片microRNA和靶基因联合研究，平台介绍 microRNAPlatformProducer高通量测序microRNA sequencingIllumina杂交芯片Exiqon microarrayExiqonPCR芯片miRNome & Focus PCR panel ExiqonPCR芯片miRStarTM H

14、uman Cancer Focus miRNA PCR Array ArraystarmRNAPlatformProducer高通量测序microRNA sequencingIllumina杂交芯片Gene profiling microarrayAgilentPCR芯片Pathway Focused PCR panelQiagen康成生物技术服务：一站式from Sample to DatamicroRNA芯片和表达谱芯片联合应用，数据分析浅蓝色,圆形节点为靶基因红色,方形节点为miRNAMolecular oncology 2013 (IF：5.935)miRNA-mRNA-network

15、microRNA芯片实验由康成提供技术服务microRNA芯片和mRNA表达谱芯片联合应用，案例 miR-135amiRNA芯片FOXM1调控miR-135a生物信息学Vs 表达谱 CHIP-PCR siRNA/过表达 FOXM1IHCmiR-135a Gain of function/Loss of function检测增殖，凋亡，侵袭变化PT/PVTT sample ISH/ qPCRmiR-135a表达水平的相关性分析Kaplan-Meier 生存分析up-regulated in PVTTIn vitromiR-135a In vivoGain of function/Loss of

16、function检测肿瘤侵袭和转移miR-135a靶基因MTSS1靶基因预测 Vs 表达谱过表达miR-135a MTSS1 WB 报告基因实验临床相关研究细胞和组织水平细胞和分子水平Real time PCRPVTT(门静脉癌栓)PT（软组织肿瘤）microRNA芯片和表达谱芯片实验由康成提供技术服务Shupeng Liu., et al. Journal of Hepatology , 2011 ( IF:10.401) microRNA和靶基因联合研究，平台介绍 microRNAPlatformProducer高通量测序microRNA sequencingIllumina芯片Exiqo

17、n microarrayExiqonPCR芯片miRNome & Focus PCR panel ExiqonPCR芯片miRStarTM Human Cancer Focus miRNA PCR Array ArraystarmRNAPlatformProducer高通量测序microRNA sequencingIllumina芯片Gene profiling microarrayAgilentPCR芯片Pathway Focused PCR panelQiagenPlatform for both miRNA & target mRNA profilingProducerHuman Can

18、cer Focus miRNA & Target mRNA PCR ArrayArraystarmiRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array一张PCR芯片，一次PCR实验，同时检测microRNA(184)和靶mRNA(178) microRNA表达和mRNA表达变化 & microRNA对靶基因的调控miRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array184个关键的肿瘤相关microRNAs 通过海量文献和数据库挖掘筛选 覆盖主要肿瘤类型: lung, breast, prostate,

19、colorectal, gastric, ovarian, pancreatic, and liverCancer miRNAs184Spike-in Controls (SP)1Small nuclear or small nucleolar RNA reference controls (Ref)3Housekeeping miRNA controls5Cancer TypemiRNAsgastric cancer97liver cancer113ovarian cancer123colorectal cancer130pancreatic cancer139prostate cancer

20、140breast cancer157lung cancer156miRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array178 个靶基因(mRNA)，基于严格的筛选标准和海量研究结果筛选：Arraystar专门的microRNA靶基因数据库；至少有三个经典数据库支持，例如miRBase, miRanda和TargetScan等 ； 靶基因（mRNA）按照权重并排序，挑选出排名靠前的文章研究结果支持Nat Rev Cancer (2009) 9:293-302workflowSuperior performance: Tm normalization

21、optimalPCR TmTm normalization to ensure uniform and optimal performancemiRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array研究思路图实验组 (n=6）Vs 对照组（n=6） 差异表达的microRNA和mRNA microRNA和靶基因 microRNA和mRNA的表达相关性分析快速筛选microRNA-mRNA后续功能或机制研究miRStar Human Cancer miRNA & Target mRNA PCR Array讲座内容 microRNA 历史的简单回顾和现况

22、介绍 microRNA的biomarker研究 microRNA和mRNA的联合研究 microRNA和lncRNA的联合研究 microRNA和DNA甲基化的联合研究 康成生物研究平台，实验服务和数据分析lncRNALonger than 200 ntRegulate gene expression： epigenetic control, transcriptional regulation,post transcriptional regulation microRNAsmall RNAs around 22 nt Targeting mRNA：translational repress

23、ion,mRNA degradationmicroRNA和lncRNA的联合研究 microRNA sponge ceRNA人工合成microRNA sponge：研究microRNA功能的重要方法内源性的microRNA sponge：非编码RNA的重要功能Developmental Cell 2013Endogenous miRNA Sponge lincRNA-RoR Regulates Oct4, Nanog, and Sox2 in Human Embryonic Stem Cell Self-RenewalceRNA研究实例：OCT4和OCT4-pg4 in HCCCarcinog

24、enesis 2013ceRNA ：Competing endogenous RNA lncRNA和目标基因结合共同的microRNA lncRNA和目标基因的表达水平正相关 microRNA表达是否受影响？OCT4-pg4 is abnormally activated in HCCOCT4-pg4 can upregulate OCT4 protein in HCCceRNA是非编码RNA调控基因功能的重要方式Front.Genet. 2014.能够发挥ceRNA作用的分子越来越多：lincRNA，circRNAmicroRNA芯片和lncRNA芯片联合应用，思路实验组 (n=6）Vs 对

25、照组（n=6） 差异表达的lncRNA，mRNA；microRNA lncRNA结合microRNA预测microRNA靶基因(mRNA)预测 mRNA和lncRNA的表达相关性分析筛选ceRNA（lncRNA-microRNA-mRNA）ceRNA研究microRNA芯片lncRNA芯片microRNA和lncRNA的联合研究：平台ncRNAPlatformProducer芯片Human LncRNA Array V3.0 ArraystarLncPath Pathway Focused LncRNA MicroarraysCircular RNA MicroarraysmicroRNAPl

26、atformProducer高通量测序microRNA sequencingIllumina芯片Exiqon microarrayExiqonPCR芯片miRNome & Focus PCR panel ExiqonPCR芯片miRStarTM Human Cancer Focus miRNA PCR Array Arraystar康成生物技术服务：一站式from Sample to Data康成生物KANGCHENExcellence for ResearchmicroRNA和lncRNA的联合研究：数据分析miRNAmRNAlncRNAlncRNA-microRNA-mRNA的ceRNA网

27、络构建讲座内容 microRNA 历史的简单回顾和现况介绍 microRNA的biomarker研究 microRNA和mRNA的联合研究 microRNA和lncRNA的联合研究 microRNA和DNA甲基化的联合研究 康成生物研究平台，实验服务和数据分析DNA甲基化属于表观遗传范畴表观遗传定义：在基因组序列不变的情况下，可以决定基因表达与否并可稳定遗传下去的调控密码表观遗传-染色体水平： DNA 相关蛋白（组蛋白等）Rodriguez-Paredes.et al Nature Medicine 2011表观遗传：DNA甲基化和组蛋白修饰激活标志沉默标志甲基化 H3（K4、K36、K79）

28、H3（K9、K27）H4（K20）乙酰化H3（K9、K14、K18、K56）H4（K5、K8、K12、K56）H2B（K6、K7、K16、K17）甲基化 5mC抑制转录羟甲基化5hmC激活转录DNA修饰组蛋白修饰microRNA和mRNA，lncRNA一样， 在转录水平受到表观调控 主要是启动子区域的调控microRNA与表观遗传的联合研究思路1思路2 Cancers 2013 思路1：microRNA对表观遗传关键酶的调控胞嘧啶5甲基胞嘧啶5羟甲基胞嘧啶Int. J. Mol. Sci. 2013microRNA是核心分子思路1：microRNA-表观遗传关键酶受表观调控的基因关键的micr

29、oRNADNA甲基化相关的酶DNA羟甲基化相关的酶组蛋白修饰相关的酶受甲基化调控的下游基因表观调控基因表达芯片筛选microRNA思路1：Part2 表观调控和mRNA联合研究关键点：表观遗传关键酶的变化必然导致下游基因表达的变化思路1：Part1 microRNA和mRNA的联合研究关键点：microRNA的靶基因是表观遗传关键酶microRNA靶基因思路2：肿瘤中的microRNA受到表观调控DNA甲基化是主要的调控机制microRNA受到调控，表达变化思路2：表观调控microRNA表达变化靶基因表达变化microRNA表达变化DNA甲基化DNA羟甲基化组蛋白修饰转录因子microRNA

30、靶基因思路2：Part1 表观调控和microRNA表达联合分析关键点： DNA水平的变化导致microRNA表达变化 不考虑microRNA（RNA）的表达变化， microRNA甲基化（DNA）可以作为Biomarker思路2：Part2 microRNA和mRNA联合分析关键点：microRNA的表达变化导致下游靶基因表达变化思路2：肿瘤中的microRNA受到表观调控肿瘤中miR-34b/c 与miR-148a启动子发生高度甲基化miR-34b/c 与miR-148a表达下调恢复表达miR-34b/c 或miR-148a能抑制肿瘤发展PNAS. 2008应用：肿瘤中的microRNA甲

31、基化作为分子标记物J Gastroenterol 2014新进展：DNA羟甲基化（5hmC）和microRNA联合研究- Song SJ. et al. 2013 Cell新进展：DNA羟甲基化（5hmC）和microRNA联合研究- Song SJ. et al. 2013 Cell新进展：DNA羟甲基化（5hmC）和microRNA联合研究表观遗传和microRNA的联合研究：平台表观PlatformProducer基于测序MeDIP-sequencing（DNA甲基化）IlluminahMeDIP-sequencing（DNA羟甲基化）ChIP-sequencing（组蛋白修饰）基于芯片

32、MeDIP-chip（DNA甲基化）ArraystarhMeDIP-chip（DNA羟甲基化）ChIP-on-chip（组蛋白修饰）microRNAPlatformProducer高通量测序microRNA sequencingIllumina芯片Exiqon microarrayExiqonPCR芯片miRNome & Focus PCR panel ExiqonPCR芯片miRStarTM Human Cancer Focus miRNA PCR Array Arraystar讲座内容总结 体液microRNA的biomarker研究 - 推进临床检验应用 microRNA和mRNA的联合

33、研究 - microRNA功能的快速筛查 microRNA和lncRNA的联合研究 - 非编码RNA调控网络 microRNA和DNA甲基化的联合研究 - 调控microRNA的机制分析 康成生物研究平台，实验服务和数据分析Thanks for your attention!lncRNA-microRNA-mRNA构成ceRNAlncRNA-ATB upregulated ZEB1 and ZEB2 by competitively binding the miR-200 family and then induced EMT and invasion.康成生物技术服务历史，发展和前景2006

34、2009201020132014microRNA lncRNA circRNA DNA甲基化 组蛋白修饰 DNA羟甲基化 TF结合 piRNA mRNA测序PCR芯片 芯片基本芯片结果生物信息学分析：功能和标志物多平台联合分析lncRNA可以结合microRNAmiR-200 family repress EMT and tumor invasion by targeting the 3 UTRs of ZEB1 and ZEB2miR-200 family：miR-200a, miR-200b, miR-200c,miR-141, and miR-429lncRNA-microRNA-mRN

35、A构成ceRNAlncRNA-ATB upregulated ZEB1 and ZEB2 by competitively binding the miR-200 family and then induced EMT and invasion.Cell 2013 lncRNA和目标基因结合共同的microRNA lncRNA和目标基因的表达水平正相关 microRNA表达是否受影响？ceRNA ：Competing endogenous RNA microRNA与各个平台联合研究的说明 联合研究的背景 联合研究的思路 联合研究的平台 联合研究的服务：数据分析 联合研究的案例miRStar Human Cancer miRNA PCR Array一张PCR芯片，检测184个关键的肿瘤相关microRNAs 通过