天花粉蛋白抑制HeLa细胞增殖的实验研究

1、天花粉蛋白抑制HeLa细胞增殖的实验研究【关键词】天花粉蛋白；,HeLa细胞；,细胞凋亡摘要：目的研究天花粉蛋白(TS)对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用,讨论TS抗肿瘤的作用机制。方法采用TT法检测TS对Hela细胞的抑制作用，形态学观察、DNA电泳及流式细胞仪检测TS对HeLa细胞的诱导凋亡作用。结果TS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用，显微镜下可见细胞圆缩，胞浆凝聚等凋亡细胞的形态学改变，DNA凝胶电泳呈梯级格局，流式检测出现凋亡峰，凋亡比例具有剂量和时间依赖性。结论天花粉蛋白通过诱导细胞发生凋亡而抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。关键词：天花粉蛋白；HeLa细胞；细胞凋亡Exper

2、ientalStudyfTrihsanthinsEffetnHelaellsPrliferatinAbstrat：bjetiveTstudytheinhibitryeffetftrihsanthin(Ts)nHelaellsanditsanti-turehanis.ethdsTheantiprliferativeeffetfTSnHelaellsaseasuredithTTassay.Lightirspyasusedtbservetherphlgyhanges,DNAagarseeletrphresisandFanalysiserearrieduttexainetheinduedapptsis

3、.ResultsTheprliferatinfHeLaellsassignifiantlyinhibitedbyTS,Helaellsshedaserialfharateristihangesfapptsissuhasellvlueshrinkage,hratinndensatin;theurrenefDNAladderandapptsisratefHelaellsasdseandtiedependent.nlusinTrihsanthinaninhibittheprliferatinfHelaellsbyitsindutinfapptsis.Keyrds：Trihsanthin;Helael

4、l;Prliferatin宫颈癌是导致妇女死亡的第二大原因，严重威胁女性身体安康。天花粉蛋白Trihsanthin,TS是从葫芦科植物栝楼Trihsanthinkiriluiiaxi的块根中提取出来的一种单链核糖体失活蛋白(ribse-inativatingprtEin,RIP)，具有多种生物学效应，主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等作用1。目前，TS的抗肿瘤研究主要集中在绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤和白血病等方面23。本实验研究TS对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用，并从诱导细胞凋亡的角度讨论其抗癌作用，为药物的进一步研究开发提供实验根据。1材料与方法1.1试剂E培养基和胎牛血清FBS购自美国

5、GIBBRL公司，碘化丙啶PrpidiuIdide，PI及RNaseA(RNA酶)为Siga公司产品，噻唑蓝(TT)购自Ares公司。二甲基亚砜(DS)购自Fluka公司，TS购自上海金山制药厂纯品，规格为1.2g/l。1.2细胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存,培养于5%2，37湿化孵箱中。培养基E含10%FBS，0.1U/L青霉素，0.1U/L链霉素，取对数生长期细胞待用。1.3细胞生长抑制实验采用噻唑蓝(TT)复原法进展检测:将Hela细胞接种于96孔细胞培养板内(每孔的细胞数为2104个)，细胞贴壁后对照组换新颖培养基，实验组换用含有不同浓度TS的培养基，置2培养箱内分别培养24

6、，48，72h，去上清，参加TT溶液200l/孔，置2培养箱内培养4h，去上清，每孔参加200lDS，轻度振荡后，测定570n处光吸收值。取8孔吸收值平均数，按公式细胞抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)100%计算药物对细胞生长的抑制作用。1.4细胞凋亡的检测1.4.1细胞形态学观察将处于指数生长期的Hela细胞以不同浓度的TS处理后，倒置显微镜下观察Hela细胞的形态改变。1.4.2DNA琼脂糖凝胶电泳胰蛋白酶消化收获实验组及对照细胞,1000r/in离心5in,PBS清洗细胞两遍,NP40溶液作用细胞沉淀,参加SDS(终浓度1%)及RNase(终浓度2g/l)，5

7、6处理2h，蛋白酶K(终浓度2g/l)37作用35h，参加1/10体积的3醋酸钠及2倍体积的无水乙醇，轻轻振摇后置于-70冰箱中过夜,14000r/in离心15in，弃上清，用冰冷的70乙醇漂洗，1.2%琼脂糖凝胶30V电泳35h，紫外观察拍照。1.4.3流式细胞仪检测分别离心搜集对照组及实验组细胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后参加75%冰冷的乙醇固定,在10000r/in条件下离心5in，去乙醇，PBS洗涤两次，弃上清；用0.5lPBS重悬，参加等体积的细胞裂解缓冲液室温作用5in，加RnaseA(终浓度30g/l)置37水浴中消化30in，离心后再加人11PI染色(终浓度50g/l)避

8、光染色30in，以300目尼龙网滤过，上流式细胞仪检测，ultiyles软件分析结果。1.5数据统计分析用SPSS10.0frinds统计软件包作ANV方差分析。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1TT法测定结果20，40和80g/l的天花粉蛋白分别作用于Hela细胞后，随着作用时间的延长，细胞的生长抑制率逐渐升高,且抑制率随药物浓度增加而上升,呈一定的剂量、时效依赖性。结果见图1。图1TS对Hela细胞作用的时间-剂量曲线略2.2Hela细胞的形态学改变镜下可见(200)对照组Hela细胞始终为多角形，梭形，贴壁结实,TS处理的Hela细胞逐渐变圆,细胞体积缩小，胞浆凝缩,折光率增强,呈现凋亡

9、细胞的形态改变。结果见图2。图2Hela细胞形态改变略2.3DNA凝胶电泳图谱凝胶电泳分析经不同浓度的TS20，40和80g/l处理48h的Hela细胞DNA断裂成相差约200bp的片段，呈现凋亡细胞的梯级ladder格局，而对照组细胞DNA无断裂现象。结果见图3。图3凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳略2.4细胞凋亡的检测凋亡细胞在流式细胞仪直方图上可出现特征性的亚二倍体峰subG1peak。由表1可见,随着天花粉蛋白药物浓度的增大及作用时间的延长，凋亡细胞的比例增加，说明TS诱导Hela细胞凋亡具有时间和剂量依赖性。表1凋亡细胞在各组标本中所占的百分比时间略3讨论细胞凋亡是细胞生长、发育过程中发

10、生的一种复杂的生理过程。Dunne等4发现肿瘤的发生与细胞凋亡的调节紊乱亲密相关。有资料说明，许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡而到达治疗的目的，有效的诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的新的手段之一5。天花粉蛋白(TS)是一种有效并具有专一性的抗肿瘤药物，与一般化疗药物造成的肿瘤细胞和正常细胞两败俱伤的作用不同，它对人的外周血淋巴细胞、T细胞和羊膜细胞等正常体细胞影响极小6，具有显著优势。天花粉蛋白是型单链核糖体失活蛋白(ribse-inativatingprtEin,RIP)，能进入细胞内直接使核糖体失活。TS可以使绒毛癌细胞发生凋亡,其诱导凋亡的作用与胞内的a2+浓度升高和活性氧基团(re

11、ativexygenspeies，RS)的产生有关78。本实验将天花粉蛋白处理HeLa细胞后，HeLa细胞的生长受到明显抑制，出现凋亡的特征性改变：染色体凝聚、核碎裂等形态改变，凝胶电泳呈现典型的梯级ladder格局，流式结果可见特征性的亚二倍体峰，且凋亡细胞的比例随药物浓度的增高及作用时间的延长而增高。这些结果说明TS对Hela细胞具有良好的抑制作用和明显的诱导凋亡效应，并具有浓度和时间依赖性，初步显示了良好的药物开发前景。对其抗癌机理进展深化研究，有望应用于宫颈癌等肿瘤的临床治疗。参考文献：1ShaP,leeK,ngKB.reentadvanesintrihsanthin,aribse-i

12、nativatingprtEInithultiplepharalgialprpertiesJ.Txin.2022,45(6)：683.2汪猷，金善炜.天花粉蛋白，第2版.北京：科学出版社，2000.3孙，涂程度，吴裕圻，等.天花粉蛋白诱导胃癌细胞KN245凋亡中P53、Bl2、y蛋白表达变化J.上海医学，2001，214：291.4DunneAL,PrieE,thersill,etal.Relatinshipbeteenlngeniradisensitivity,radiatin-induedapptsisandDNAdaage/repairinhuanlnanerellsJ.BrJaner.2022,89(12)：2277.5axanDJ,ShartzPS.HarnessingapptsisfriprvedantianergenetherapyJ.anerRes,2022,63(24)：8563.6戴荣禧，徐国江，刘莲英，等.天花粉蛋白对滋养层细胞专一损伤机制的研究J.实验生物学报，1993，2624：411.7ZhangY,GngYX,aH,etal.Reativexygenspeiesinvlve