DNARNA合成常见问题解答

1、DNA/RRNA合成成 常见问题题解答处理和保存存 HYPERLINK /faq5.asp#Q1#Q1 l Q1#Q1 1. 如如何保存寡寡核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q2#Q2 l Q2#Q2 2. 如如何重悬寡寡核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q3#Q3 l Q3#Q3 3. 如如果寡核苷苷酸在室温温中放置超超过一星期期，还可以以使用吗? HYPERLINK /faq5.asp#Q4#Q4 l Q4#Q4 4. 荧荧光染料标标记的寡核核苷酸，在在储存和使使用过程中中必须特殊殊处理吗?纯化和浓浓缩 HYPERLINK /faq5.asp#Q5#Q5 l

2、 Q5#Q5 5. 如如何定量合合成的寡核核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q6#Q6 l Q6#Q6 6. 如如何通过紫紫外吸光度度值来定量量寡核苷酸酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q7#Q7 l Q7#Q7 7. 如如一个188个碱基的的寡核苷酸酸包括3个个dG,44个dC,5个dAA和6个ddT, OOD值是00.7，那那 么么它的量是是多少? HYPERLINK /faq5.asp#Q8#Q8 l Q8#Q8 8. 如如何计算寡寡核苷酸的的分子量? HYPERLINK /faq5.asp#Q9#Q9 l Q9#Q9 9. 如如何测定寡寡核苷酸的的质量? H

3、YPERLINK /faq5.asp#Q10#Q10 l Q10#Q10 110. 如如何测定寡寡核苷酸的的质量? HYPERLINK /faq5.asp#Q11#Q11 l Q11#Q11 111. 如如何测定合合成的寡核核苷酸的TTm值? HYPERLINK /faq5.asp#Q12#Q12 l Q12#Q12 112. 为为什么Biioneeer提供的的Tm值和和我们的TTm值不同同? HYPERLINK /faq5.asp#Q13#Q13 l Q13#Q13 13. 用什么么方法调整整寡核苷酸酸的浓度? HYPERLINK /faq5.asp#Q14#Q14 l Q14#Q14 14

4、. 单位换算算表合成与订订购 HYPERLINK /faq5.asp#Q15#Q15 l Q15#Q15 15. 如何合合成寡核苷苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q17#Q17 l Q17#Q17 166. 标准准寡核苷酸酸结构 HYPERLINK /faq5.asp#Q17#Q17 l Q17#Q17 177. Biioneeer能合成成的最长的的寡核苷酸酸是多长? HYPERLINK /faq5.asp#Q18#Q18 l Q18#Q18 18. 当我预订订50nmmol的寡寡核苷酸，产产品却不足足50 nnmol，为为什么? HYPERLINK /faq5.asp#Q19

5、#Q19 l Q19#Q19 119. 能能合成出高高百分比“G”的寡核苷苷酸吗? HYPERLINK /faq5.asp#Q20#Q20 l Q20#Q20 220. 能能提供寡核核糖核酸(RNA)合成吗? HYPERLINK /faq5.asp#Q21#Q21 l Q21#Q21 21. 合成的寡寡核苷酸在在3 或或5位有有磷酸基吗吗? HYPERLINK /faq5.asp#Q22#Q22 l Q22#Q22 22. 简并引引物及通用用引物是什什么?纯化方法法 HYPERLINK /faq5.asp#Q23#Q23 l Q23#Q23 23. 怎样纯化化合成的寡寡核苷酸? HYPERLI

6、NK /faq5.asp#Q24#Q24 l Q24#Q24 24. 用于芯片片分析的660 meer寡核苷苷酸如何被被纯化呢?修饰寡核核苷酸 HYPERLINK /faq5.asp#Q25#Q25 l Q25#Q25 255. 修饰饰寡核苷酸酸 HYPERLINK /faq5.asp#Q26#Q26 l Q26#Q26 26. 作为反义义脱氧寡核核苷酸的硫硫磷酰化寡寡核苷酸实验 HYPERLINK /faq5.asp#Q27#Q27 l Q27#Q27 27. 怎样制制备双链DDNA?Q1. 如如何保存寡寡核苷酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP

7、HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 通常，寡寡核苷酸应应该-200保存，该该温度下能能稳定保存存一年以上上。寡核苷苷酸在溶液液中较为稳稳定，但易易被污染的的核酸酶降降解，因此此我们建议议应干燥储储存。若要要以溶液形形式储存，最最好将其分分装在几管管中分别保保存，反复复冻融会使使寡核苷酸酸降解。另另外，酸性性条件下，DDNA会因因为脱嘌呤呤作用而降降解；碱性性条件会使使磷酸二酯酯键水解断断裂。Q2. 如如何重悬寡寡核苷酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#T

8、OP l TOP#TOP TOP 为便于于长期保存存，我们建建议使用TTE缓冲液液(10 mM TTris-HCl,1 mMM EDTTA, ppH8.00)，而不不用无菌水水来溶解寡寡核苷酸。重悬后，寡寡核苷酸应应该在-220癈保存存以长期使使用。寡核核苷酸在无无菌水中很很难溶解，加加一定量的的NaOHH有助于寡寡核苷酸在在水中溶解解。Q3. 如如果寡核苷苷酸在室温温中放置超超过一星期期，还可以以使用吗？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 脱水的的寡核苷酸酸是长期稳稳

9、定的。即即使在溶液液状态寡核核苷酸也相相当稳定，通通常情况(没有引入入使寡核苷苷酸降解的的污染物)即使在室室温中放置置超过一星星期也能使使用。Q4. 荧荧光染料标标记的寡核核苷酸，在在储存和使使用过程中中必须特殊殊处理吗？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 如果暴暴露在光线线下，荧光光染料标记记的寡核苷苷酸比未标标记的寡核核苷酸更易易降解，荧荧光强度会会逐渐降低低。为了保保持其荧光光效能，荧荧光染料标标记的核苷苷酸应避光光-20保存。由由于Cy33和Cy55在pH大大于

10、9时易易被降解，所所以Cy33和Cy55修饰Q5. 如如何定量合合成的寡核核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 合成的的寡核苷酸酸的量非常常少，不能能直接称重重来定量。通常通过过测量紫外外吸光度值值(OD值值)来定量量。Q6. 如如何通过紫紫外吸光度度值来定量量寡核苷酸酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 寡核苷苷酸的量经经常用ODD值来

11、描述述。1个OOD值是体体积1mll寡核苷酸酸溶液，在在内径1ccm的比色色杯中的吸吸光度值，约约为33 mg寡核核苷酸，序序列不同的的寡核苷酸酸OD值有有所不同。因为在2260nmm处单个碱碱基的吸光光度值是已已知的，所所以序列已已知的寡核核苷酸的浓浓度就可以以测定。dT: 88.8 mml/mmoldG: 111.7 ml/mol dC: 77.3 mml/mmol dA: 115.4 ml/mol 对于一一段寡核苷苷酸，它的的吸光度等等于每个碱碱基的数目目乘以它的的吸光系数数，然后将将4种碱基基的结果加加起来就是是整个寡核核苷酸的吸吸光度。它它的浓度可可通过下式式来计算 ：O.D. =C

12、 (内径11 cm的的比色杯)Q7. 如如一个188个碱基的的寡核苷酸酸包括3个个dG,44个dC,5个dAA和6个ddT, OOD值是00.7，那那么它的量量是多少？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP首先，用下下面公式计计算18个个碱基的寡寡核苷酸的的吸光度是是多少 ： = 111.7 3 + 7.3 4 + 15.44 55 + 88.8 6 = 1944.1 (ml/ mmolle)然后，通过过下式来计计算寡核苷苷酸的浓度度：O.D. =C，CC = OO.D./

13、CC = 00.7 /194.1 = 0.00036 (moll/ml) = 33.6 (nmoll/ml)最后，ODD值为0.7的188个碱基寡寡核苷酸的的浓度是33.6nmmol。Q8. 如如何计算寡寡核苷酸的的分子量? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP寡核苷酸的的分子量可可以通过下下式进行计计算：M.W. =(NAA 2449.2) + (NC 2255.2) + (NNG 265.2) + (NTT 2240.22) + (寡核苷苷酸长度-1) 63.98 +

14、2.002NA =总总 A数NC = 总C数NG = 总G数NT = 总T数Q9. 如如何测定寡寡核苷酸的的质量? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 通常，合合成的寡核核苷酸的质质量用摩尔尔数来描述述，常用nnmol。用寡核苷苷酸的摩尔尔数或寡核核苷酸的分分子量可以以计算寡核核苷酸的量量： 寡核苷苷酸质量(ng) =分子量量(M.WW.)摩摩尔数(nnmol)Q10. 如果不知知道寡核苷苷酸的碱基基组成，有有什么办法法来定量合合成的寡核核苷酸？ HYPERLINK /f

15、aq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 1 OOD值 的的单 链寡寡 核苷酸酸大约333 mg，双双链 寡 核 苷 酸 约为为 50.mg。然然而对于较较短的寡核核苷酸，上上述值偏差差较大。因因此，最 好 用 Q6 中中 提 到到 的 适适合于短 寡 核 苷 酸 质 量的的计算方法法，可以 得 到 更 精 确的 结结 果。Q11. 如何测定定合成的寡寡核苷酸的的Tm值? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP

16、 l TOP#TOP TOP Tm(解链温度度)是指550%双链链被解开成成单链时的的温度。寡寡核苷酸浓浓度和盐浓浓度会影响响Tm值的的大小。Tm 值值 有 多 种 计 算 方 法 。我我 们 使使 用 近 邻邻 法 ( P N A S 88 3 ,3 7 4 6- 5 00 )来计计算。用这这种方法计计算前，也也有多种方方法来估测测。如果是是15个碱碱基以下，那那么有一种种好的方法法来估算，对对于A和TT，可以乘乘以2癈，对对于C和GG，可以乘乘以4癈然然后相加，这这叫做Waallacce法则。 Tm= 22 (A + T) + 44 (G + C)另一种方法法来估计长长链中GCC含量Tm

17、= 81.55 + 00.41(%GC) - 5500/LL + 116.6 logM(L:寡核核苷酸的长长度；M:1价阳离离子的浓度度) 但这些些方法不能能消除碱基基堆积的影影响，结果果并不准确确，所以近近邻法被广广泛的应用用。但是，对对于在600-70 bp或115bp以以下的寡核核苷酸的测测定，近邻邻法还是有有缺点。 Biooneerr使用的近近邻法具有有新的特点点。它考虑虑到在退火火过程中不不同的碱基基序列的影影响，并且且通过热力力学来测定定，可以更更有效的测测定Tm值值。比如55 -GGC-3 和5 -CGG-3的的序列用热热力学方法法测定结果果是不同的的。计算方方法如下： 依靠热热

18、力学方法法，焓和熵熵通过两个个碱基来确确定。ssalt是指一价价阳离子的的浓度，Oliggo是指指反应过程程中的寡核核苷酸浓度度。R是指指气体常数数(1.9987 ccalKK-1mool-1)。Biooneerr用近邻法法计算Tmm值时，使使用的是550 mMM的盐浓度度和1 nnM的寡核核苷酸的浓浓度。 Biooneerr会给每一一个用户提提供Tm值值，但这只只是估计值值，我们不不能保证精精确性，因因此这个值值仅供用户户参考。如果没有扩扩增出产物物，你可以以把退火温温度降到TTm值以下下45癈癈。如果有有许多非特特异性的产产物，你需需要改变实实验条件如如提高退火火温度以得得到正确的的产物。

19、Q12. 为什么BBioneeer提供供的Tm值值和我们的的Tm值不不同? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP Biooneerr使用的TTm值的计计算方法和和我们通常常的计算方方法是不同同的。我们们通常只是是简单的乘乘以A、GG、C、TT的数目，但但序列不同同碱基的TTm值亦会会不同。如如Tm值取取决于序列列中的每一一个碱基，即即使碱基数数相同但序序列不同时时，Tm值值也将不同同。Q13. 用什么方方法调整寡寡核苷酸的的浓度？ HYPERLINK /faq5.asp#T

20、OP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 首先，在在Bionneer提提供的数据据表或报告告单中的1100 ppmol/靗，是用用来加入TTE缓冲液液或无菌水水，以使管管中寡核苷苷酸的终浓浓度达到1100 ppmol/靗。例如如,数据表表或报告单单中是1889.0和和209.2时，则则应向两个个管中分别别加入相应应量的无菌菌水,即可可使每个管管中的寡核核苷酸浓度度达到1000 pmmol/l。每一一个管中寡寡核苷酸含含量通过下下式可以计计算如下：189.00l1100 ppmol/l = 18,900 pmoll =

21、118.9 nmoll,209.22l1100 ppmol/l = 20,920 pmoll = 220.922 nmool如果所要的的终浓度是是0.5M，pmmol/l需要换换M。100 ppmol/l = 1000 1006pmmol/1106ll = 11001106 10-112mool/L = 100-4mmol/LL= 10-41106 mol/L= 1022moll /L= 1000 M终浓度换算算为1000M，如如果需要的的浓度是00.5MM的，加入入终体积的的1/2000的引物物量，以使使引物终浓浓度为0.5M。PCR反应应的终体积积是50l，所以以需要加550/2000 =

22、 0.255l的引引物，以使使终浓度达达到0.55M。Q14. 单位换算算表 HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP科学系统单单位: 10-1 = decii d 1011 = ddeca da 10-2 = centti cc 1022 = hhectoo h 10-3 = millli mm 1033 = kkilo k 10-6 = micrro mm 1066 = mmega M 10-9 = nanoo n 1099 = ggiga G 10-12 = picco

23、pp 10112 = teraa T 10-15 = femmto f 10115 = petaa P 10-18 = attto aa 10118 = exa E 10-21 = zeppto z 10221 = zettta ZZ 10-24 = yoccto y 10224 = yottta YY寡核苷酸单单位换算的的例子:1 pmool/ll= 1110-122 moll/1110-6LL= 1110-6 mol/L= 1mmol/LL= 1MMQ15. 如何合成成寡核苷酸酸? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.

24、asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 目前最最流行的用用于合成寡寡核苷酸的的方法是通通过使用“亚磷酸三三脂”方 法 将将 单 体体 连 接接 ，形 成 天 然的 3-55磷 酸 二二 脂 键 。Kosster发发现了-氰乙基亚亚磷酰胺并并作为构建建单体，现现在普遍的的用于寡核核苷酸的合合成(Nuucl. Acidds Rees. 11984, 12,45399; Teetrahhedroon Leett. 19833, 244,58443)。通通过“亚磷磷酸三脂”的方法使使用-氰氰乙基亚磷磷酰胺，合合成效率能能够达到(98%)而合成时时间比其它它寡核苷酸酸的合成方方法更短。而且，

25、由由于单体-氰乙基基亚磷酰胺胺在激活以以前很稳定定，这是对对合成寡核核苷酸来说说所必需的的，他们能能储存更长长的时间。当寡核苷苷酸共价的的连接在固固相载体上上就可以使使其不被过过量溶解-氰乙基基亚磷酰胺胺和结合试试剂的作用用下，寡核核苷酸被合合成。在各各种各样的的固相载体体中，可控控孔度玻片片已经在近近年广泛使使用了，这这种玻片是是由均匀的的玻璃基质质组成，上上面有固定定尺寸的孔孔。 整个寡寡核苷酸的的合成通过过一系列的的反应完成成，其中包包括四个循循环反应：脱保护，连连接，氧化化，加帽。脱保护 通过第第一个循环环脱保护护，CPGG裂解出55保护基基团DMTT。酸性条条件对于脱脱保护是必必需的

26、，通通常使用33三氯乙乙酸。据报报道，寡核核苷酸在酸酸性环境中中易脱嘌呤呤，尤其是是对于腺苷苷。因为三三氯乙酸有有很强的酸酸性，所以以用三氯乙乙酸脱保护护时，反应应时间不应应该太长。比起三氯氯乙酸，二二氯乙酸酸酸性较弱，能能够在一些些情况下避避免脱嘌呤呤问题。脱脱保护后产产生的DMMT阳离子子呈现出一一种深橘色色。通过测测定吸光度度，来监测测反应效率率。连接 脱保护护后，CPPG上的55-羟基基暴露，结结合核苷-氰乙基基亚磷酰胺胺，三亚磷磷酸酯氧化化变成磷酸酸三脂，然然后按顺序序连接。对对于核苷-氰乙基基亚磷酰胺胺，为了避避免合成寡寡核苷酸过过程中负反反应的发生生，碱基的的环外氨基基被保护以以

27、免形成酰酰胺结构。苯甲酰基基用于保护护酰苷和胞胞苷。另一一方面，异异丁酰基用用于鸟苷碱碱基保护。胸苷碱基基中没有环环外的胺基基，所以不不需要保护护。-氰氰乙基亚磷磷酰胺用于于保护所有有核苷的55-羟基基。 因为核核苷2-氰氰乙基亚磷磷酰胺在正正常条件下下非常稳定定，不能直直接和正在在合成链上上游离的55-羟基基功能基团团发生反应应。所以，它它们必须首首先通过一一种弱酸性性激活剂激激活。在各各种激活剂剂中，四唑唑作为标准准激活剂具具有很强的的激活作用用。四唑已已经被认为为具有双重重作用：它它质子化22-氰乙基基亚磷酰胺胺的二异丙丙氨基，产产生亲核基基团，形成成具有活性性的四唑膦膦中间产物物。用这

28、种种被激活的的核苷亚磷磷酰胺试剂剂耦联反应应快(不到到2分钟)，产量高高。氧化 新合成成的亚磷酸酸盐和核苷苷酸之间的的键合不稳稳定，对酸酸和碱均很很敏感。因因此，三价价的亚磷酸酸三脂被氧氧化成五价价的磷酸三三脂。碘是是温和的氧氧化剂，在在碱性的四四氢呋喃溶溶液中作为为氧的供体体。此步反反应非常快快，在三十十秒内就可可以完成。加帽 因为结结合反应在在特定的时时间内不能能够定量，在在每一步结结合反应中中都有一小小段提前终终止的序列列产生。如如果这些序序列进一步步参与反应应，产物将将很难从混混合序列中中分离出来来。通过加加帽，即将将自由羟基基乙酰化，解解决了这个个问题。乙乙酰化可由由强的乙酰酰化试剂

29、完完成，该试试剂是由等等摩尔的醋醋酸酐和NN-甲基咪咪唑组成，反反应可在330秒内完完成。氧化化后，核苷苷酸加入，循循环完成。寡核苷酸酸合成后，移移去增长链链5-末末端的DMMT基团，下下一个核苷苷酸的聚合合循环开始始。整个寡寡核苷酸合合成后，借借助浓氨水水的处理，寡寡核苷酸从从固相载体体上分离，同同时碱基和和磷酸基去去保护。Q16. 标准寡核核苷酸结构构 HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOPQ17. Bionneer能能合成的最最长的寡核核苷酸是多多长? HYPERLIN

30、K /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP合成量0.025 moll: 500 merr合成量0.05 mol: 50 mer合成量0.1 mmol: 100 mer合成量0.2 mmol: 100 mer合成量1.0 mmol: 130 merQ18. 当我预订订50nmmol的寡寡核苷酸，产产品却不足足50 nnmol，为为什么? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 5

31、0 nmoll的寡核苷苷酸合成不不意味着能能得到500 nmool的最终终产品。550 nmmol是指指在寡核苷苷酸合成开开始时固相相载体负荷荷的数量。寡核苷酸酸通常是反反应所要求求的量而不不是最终产产率，用户户得到的核核苷酸的数数量自然要要比要求的的少。终产产率受寡核核苷酸长度度、碱基组组成和连接接效率的影影响。Q19. 能合成出出高百分比比“G”的的寡核苷酸酸吗? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 众所周周知，含高高百分比的的“G”寡寡核苷酸不不容易被合合成，特别别

32、是序列中中包含一行行“G”。有报道，如如果有四个个或更多的的“G”排排成一行，寡寡核苷酸将将趋向形成成鸟嘌呤四四聚体(PPoon and MacGGregoor,Biiopollymerrs, 19988, 455, 4227 -4434)。通过次黄黄嘌呤核苷苷置换部分分G，就能能避免四聚聚体鸟苷的的形成。Q20. 能提供寡寡核糖核酸酸(RNAA)合成吗吗？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 是的，我我们能合成成。我们能能提供2-OH或或/和2-O-甲基基结构的寡寡核糖

33、核苷苷酸，也能能合成由DDNA和RRNA组成成的寡核苷苷酸。Q21. 合成的寡寡核苷酸在在3 或或5位有有磷酸基吗吗？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 如果没没有殊要求求,合成的的寡核苷酸酸在3或或5端均均无磷酸基基。如果你你想要3或5有有磷酸基的的寡核苷酸酸，你应该该在订单上上标注清楚楚在3或或5端进进行磷酸化化修饰。Q22. 简并引物物及通用引引物是什么么？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5

34、.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOPR - a 或 gY - c 或 tM - a 或 cK - g 或 tS - g 或 cW - a 或 tV - a, cc或 gH - a, tt或 cB - g, tt或 cD - g, aa或 tN II:A I:TT=I:GG.形成稳稳定的碱基基配对。包包含肌苷的的寡核苷酸酸借助PCCR或探针针杂交可用用于检测或或分析不同同的或相似似的DNAA序列。硫磷酰修饰饰法： 经硫磷磷酰基化的的寡核苷酸酸对核酸内内切酶和核核酸外切酶酶的降解有有很好的抵抵抗作用，这这种特性能能增加反义义寡核苷酸酸链在细胞胞内的效果果。我们可可以依据用用户的需要

35、要，在寡核核苷酸部分分序列中用用硫磷酰基基置换核苷苷酸内部的的磷酸基(在磷酸基基中用一个个硫原子代代替一个氧氧原子)。双重修饰法法(5荧荧光素3 Dabbsyl & 5荧光素钠钠3 TTAMRAA 修饰)： 双重标标记的寡核核苷酸可在在实时PCCR中用来来检测DNNA的扩增增。他们或或者在反应应中裂开(如TaqqMan探探针)或者者在互补目目的DNAA存在的情情况下经历历一种构型型变化(如如分子信标标)。许多多探针利用用寡核苷酸酸形成反向向环构型的的特征进行行设计。实实际上，通通过除去供供体荧光基基团的淬灭灭作用，探探针可指示示反应的发发生。PCR检测测的5 核酸酶测测定法(TTaqMaan探

36、针)： 5核核酸酶测定定法被用来来实时监测测反应。这这种测定法法利用耐热热性DNAA聚合酶的的5核酸酸外切酶的的活性来检检测正在进进行的反应应。耐热性性DNA聚聚合酶能够够从链状DDNA的55端水解解核苷酸，旧旧链在合成成一条新链链时被置换换。裂解主主要发生在在置换的单单链部分和和DNA配配对的双链链部分的连连接处。这这导致单核核苷酸和寡寡核苷酸从从置换的DDNA链的的5末端端被释放。DNA聚聚合酶的这这种特性被被用来监测测反应。在在5端核核酸酶检测测法中FRRET DDNA双重重探针是短短的寡核苷苷酸，与扩扩增DNAA靶序列和和修饰的33端互补补，以至于于他们不能能在3端端延长。他他们在3和

37、5末末端用荧光光基团标记记。报告荧荧光染料被被放置在55末端，粹粹灭剂被放放置在探针针的3末末端。在完完整的探针针中，染料料的荧光性性被消除，在在PCR反反应中探针针与靶序列列杂交 ，借借助耐热性性DNA聚聚合酶的55核酸酶酶的活性，淬淬灭剂与报报告基因分分离，从而而恢复报告告基因的荧荧光性。两两个探针被被使用，一一个用于正正常序列，另另一个用于于3 bpp缺失的互互补序列。每个探针针在5末末端有不同同的报告荧荧光，并且且一个相同同的粹灭剂剂染料连接接在从5末端数的的第七个核核苷酸上。靶DNAA的鉴定由由荧光发射射光谱决定定。分子信标： 严格的的说，荧光光淬灭在使使用DABBCYL分分子指示标

38、标中不是FFRET相相关的，因因为它不能能满足重叠叠光谱的标标准。然而而，以FRRET为基基础的淬灭灭也能被使使用。分子子信标被作作为杂交探探针后不久久被应用于于PCR，利利用它们能能够同互补补DNA杂杂交的原理理，它们能能够被用来来监测一个个正在进行行中的反应应和在实时时PCR中中区别等位位基因。反反应完成后后，反应物物加入固定定有分子信信标的微量量滴定孔中中，借助读读取产生的的荧光检测测产物。或或者还可用用封闭试管管和实时程程序来检测测。在这种种情况下，分分子信标被被直接加入入到PCRR混合物并并且与扩增增反应中新新合成的DDNA杂交交。与TaaqMann探针相比比，分子信信标优势在在于能

39、够进进行多重PPCR检测测，因为，在在理论上，他他们能同时时测定更多多的产品。Q26. 作为反义义脱氧寡核核苷酸的硫硫磷酰化寡寡核苷酸 HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 随着我我们对分子子生物学的的理解不断断加深，我我们慢慢获获得对分子子水平疾病病的认识。合理的药药物设计变变得更加可可行。特别别是在蛋白白质水平上上分子间的的反应能够够被完美的的设计，通通过生物合合理的途径径来提高结结合性，分分子间的相相互作用成成功的被应应用和被最最佳化。合合成的脱氧氧寡核苷酸酸(ODN

40、Ns)已经经被Zammecniik和Sttepheensonn提出作为为一种新的的潜在的治治疗方法，这这种方法以以一种合理理的方式与与信使RNNA疾病关关联蛋白相相互作用，并并且特异的的抑制它的的合成。 这种被被称为反义义策略的方方法的优势势在于，通通过众所周周知的Waatsonn-Criick碱基基配对法则则，即单链链核酸与互互补的寡核核苷酸链相相互作用形形成双螺旋旋结构。每每个蛋白分分子均遵循循分子生物物学的基本本机制合成成：一个基基因(双链链DNA)携带一种种特定蛋白白质的遗传传信息，被被转录成作作为信息携携带者的单单链mRNNA，再以以此作为模模板在核糖糖体指导蛋蛋白质的合合成(翻译译

41、)。因此此，反义策策略不被限限制于特定定类型的疾疾病而能够够被广泛地地应用。天天然的寡核核苷酸(DDNA和RRNA)不不能够达到到作为反义义药物候选选物的标准准，不同的的化学修饰饰将克服现现存的障碍碍，它将被被细胞吸收收，抵抗核核酸酶的降降解和提高高与mRNNA的亲和和力。首先先，脱氧寡寡核苷酸(ODNss)必须能能够穿越细细胞膜到达达细胞质或或细胞核。一旦进入入细胞内部部，ODNNs就必须须抵抗核酸酸酶的降解解。最后，为为了抑制致致病基因的的表达，OODNs必必须能够特特异性结合合并对靶mmRNA有有高度的亲亲和力。早早期在组织织培养中观观察到的OODNs的的活性后曾曾认为，这这些理论上上的障碍不不值得担心心。然而，最最近文章的的数据分析析显示这些些理论上的的障碍确实实存在。 最近的的研究焦点点在于用化化学方法改改善ODNNs的特性性，主要集集中在核苷苷酸酶抵抗抗力和mRRNA亲和和力的提高高方面。mmRNA亲亲和力对于于反义策略略非常重要要，它常常常