细菌学诊断技术.吉文汇

1、细菌学诊断技术一、细菌形态学检查法油镜的使用及细菌基本形态的观察细菌抹片的制备与染色二、细菌的分离培养与鉴定培养基的制备与无菌器材的准备细菌的分离培养与无菌操作接种技术细菌的生物化学试验血清学检测分子生物学鉴定三、药物敏感试验四、病原菌的微生物学检查 一、细菌基本形态观察（一）油镜的使用普通光学显微镜机械装置反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等光学系统是一种放大倍数较高（95100倍）的物镜一般都刻有放大倍数（如95、100等）和特别的标记，以便于认识。国产镜多用油字表示，国外产品则常用Oil（Oil Immersion）或HI（Homo

2、geneous Immersion）作记号。油镜上也常漆有黑环或红环油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一个标志。 检查细菌标本多用油镜进行1、什么是油镜？空气玻璃油光源2、油镜的原理（2）油镜头与栽玻片之间为空气所隔时，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。（3）在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。（1）油镜头的晶片细小，进入镜中的光量亦较少，其视野较高倍镜为暗。3、油镜的使用方法（1）对光采取最强亮度（升高集光器，开大光圈，调好反光镜等）不可直

3、对阳光（2）滴油标本上有菌影的地方滴1滴柏木油，切勿过多（3）标本放置或移置载物台正中，转换油镜头，镜头浸入油滴中，使镜头几乎与标本面接触为度。不应接触慢慢降低油镜头（4）左眼由接目镜注视镜内，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒，至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止此时严禁用粗螺旋降下油镜筒注意镜头离开油，就不能看清，重新按上述的步骤进行。4、油镜使用过后（1）立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶解并拭去油渍，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。（2）将显微镜各部还原，聚光器下降，反光镜垂直于镜座，镜头转成八字形，以免与聚光器发生碰撞。 （3）最后用柔软纱布清洁载物台等机械

4、部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。5.细菌基本形态观察球菌：单球、双球、 链球、葡萄球菌杆菌：短杆、长杆、棒杆、梭杆等。螺菌：弧菌、螺旋菌、螺旋体等。(1)球菌 链球菌：注意其链状排列，链的长短，个体的形态。 葡萄球菌：注意其无一定次序，无一定数目，不规则地堆放在一起的形态。气球菌 Aerococcus白联球菌Leuconostoc片球菌Pediococcus消化链球菌 Peptostreptococcus葡萄球菌 Staphylococcus链球菌Streptococcus(Hemoculture)(2)杆菌 单杆菌：注意其单个散在的状态，菌体外形、大小，菌端的形态。 双杆菌：注意其成双的

5、排列以及菌体外形、大小，菌端的形态。 链杆菌：注意其成链状的排列，链的长短，菌体的外形、大小，菌端的形态。大肠杆菌 E.coli大肠杆菌 E.coli沙门氏菌 Salmonella.sp布氏杆菌Bacterium burgeri 铜铝假单胞杆菌（绿脓杆菌）炭疽杆菌 anthrax Bacillus蜡样芽孢杆菌 Cerea bacillus枯草杆菌Bacillus subtilis产气荚膜梭菌Clostridium perfringens产气荚膜梭菌Clostridium perfringens乳酸杆菌lactobacilli结核杆菌Tbc (SEM)枯草芽孢杆菌Bacillus subtili

6、s (SEM)沙门氏菌salmonella(SEM)大肠杆菌(SEM)单核细胞增生性李氏杆菌(SEM)产气荚膜梭菌(SEM)炭疽繁殖体(SEM)空肠弯曲杆菌(SEM)双歧杆菌(3)螺旋状菌 弧菌：注意其弯曲成弧形以及菌体大小，菌端的形态。 螺菌：注意其具有两个弯曲以上的螺旋状及菌体的长度、大小，菌端的形态。 梅毒螺旋体Microspironema pallidum钩端螺旋体特殊结构: 荚膜芽孢鞭毛异染颗粒破伤风芽孢杆菌 Bacillus tetani（二）细菌的抹片制备与染色 细菌个体微小，无色而半透明，折光性弱，在普通光学显微镜下观察活细胞时，只能见其大致轮廓。制成抹片和染色后，则能较清楚地

7、显示细菌的形态及某些构造。还可根据细菌呈现出的不同颜色反应而对其进行鉴别。 原理1、细菌抹片的制备（1）玻片准备载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。滴95%酒精23滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。若仍不能去除油渍，可再滴12滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过如有残余油渍，可按下列方法处理：（2）抹片切忌涂片太厚，否则不利 于染色和观察。所用材料不同，抹片的方法有差异液体材料：液体培养物、血液、渗出 物、 乳汁等。 直接用灭菌接种环勾取1环材料，于玻片中央涂抹于玻片上即可。但要注意将管底沉淀物摇匀，以免影响涂片效果。固体培养物 用经酒精

8、灯火焰烧过的接种环，蘸取生理盐水2环于清洁无油脂的载玻片中央，再勾取细菌的固体培养物少许混于生理盐水中，均匀涂布成适当大小的薄层。组织涂片 用灭菌的剪刀、镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。(3)干燥 将抹片置于空气中让其自然干燥。 (4)固定 有两种方法： 火焰固定 将已干燥的抹片菌膜向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次（以不烫手背为宜）。 化学固定 加数滴甲醇于玻片上，固定2-3分钟，自然挥发干燥。抹片如做瑞氏染色，则不必先做固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。 固定的目的 :除去抹片上的水分，使菌体蛋白附着在

9、载玻片上，以防染色过程中被水冲掉。 使抹片易于着色，变性的蛋白质着色力强。 能杀死抹片中的部分微生物。2、细菌常用染色法（1）简单染色法 只用一种染料进行染色的方法。只能显示出细菌的外形，大小及排列。 美蓝染色法原理：细菌菌体蛋白的等电点多偏酸性（pH2.0-5.0），而细菌生活环境的pH在7.0左右，此时，细菌菌体（在中性环境中）带负电荷，极易与碱性美蓝染料结合而呈蓝色。方法：在已固定好的抹片上，滴加适量（足够覆盖涂抹点即可）的美蓝染色液，经12min，水洗，干燥（可用吸水纸吸干，或自然干燥，但不能烤干），镜检，菌体呈蓝色。 (2)革兰氏染色法 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法

10、，通过此法染色，可将细菌鉴为革兰阳性菌 和革兰氏阴性菌 两大类。 G+G-革兰氏染色原理利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同 四种染料 四个步骤 初染碱性染料 (草酸铵结晶紫溶液)1-3min水洗 媒染媒染剂 (碘液)其作用是增强染料与菌体的亲和力，加强染料与细胞的结合1-2min水洗 脱色0.5-1min水洗 脱色剂(乙醇)将染料溶解，使被染色的细胞脱色，利用不同细菌对染料脱色的难易程度同，而加以区分。复染复染剂(蕃红溶液)使经脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色的细菌进行比较10-30s水洗 干燥后镜检观察 附带载玻片 的革兰氏染色法 (3)抗酸性染色法 分枝杆菌属细菌其细胞壁含有大

11、量脂质，主要是分枝菌酸 ，一般不易着色，如果经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸酒精的脱色，所以又称抗酸杆菌。 用普通染色法不被着色，需在加热条件下与石炭酸复红牢固结合形成复合物。而且用酸性乙醇处理不能使其脱色，故菌体染成红色。此染色法是鉴别分枝杆菌属的染色法萋-尼（Ziehl-Neelsen）氏染色法首先在已干燥、固定好的抹片上滴加较多的石炭酸复红染色液，在玻片下以酒精灯火焰微加热至产生蒸汽为度（不要煮沸），维持微微产生蒸汽35min，水洗。然后用3盐酸酒精脱色，至标本无色脱出为止，充分水洗。再用碱性美蓝染色液复染约1min，水洗。最后吸干，镜检。 抗酸性细菌呈红色非抗酸性细菌呈蓝

12、色温染（石炭酸复红溶液） 5 min脱色（3%盐酸酒精溶液） 0.5-1 min复染（碱性美兰溶液） 0.5 min水洗，干燥，镜检结核杆菌（抗酸染色）(4)瑞氏染色法瑞氏染料是美蓝与酸性伊红钠盐混合而成，当溶于甲醇后即发生分离，分解成酸性和碱性两种染料。由于细菌带负电荷，与带正电荷的碱性染料结合而成蓝色。组织细胞的细胞核含有大量的核糖核酸镁盐，也与碱性染料结合成蓝色。而背景和细胞浆一般为中性，易与酸性染料结合染成红色（瑞氏染色液中一般含有甲醇，故组织标本的瑞特氏染色时，一般不需要固定）。常用的瑞氏染色方法有以下两种:（1）抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于其上，为了避免很快变干，染色液可适当多

13、加些，或看情况补充滴加；经13min，再加约与染色液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片（或用嘴轻轻吹匀），使之与染液混合均匀，经5min左右，直接用水冲洗（注意：不可将染料先倾去），吸干或烘干，镜检。（2）抹片自然干燥后，按抹片点大小盖上一块略大的清洁滤纸片，在其上轻轻滴加染色液，至略浸过滤纸，并视情况补滴，维持不使变干；染色35min，直接以水冲洗，吸干或烘干，镜检。此法的染色液经滤纸滤过，可大大避免沉渣附着抹片上而影响镜检观察。细菌染色成蓝色组织细胞的细胞浆呈红色 细胞核呈蓝色 (5)姬姆萨染色法于5mL新煮过的中性蒸馏水中滴加510滴姬姆萨氏染色液原液，即稀释为常用的姬姆萨氏染色液。

14、 抹片经甲醇固定干燥后，在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛满染色液的染缸中，染色30min，或者染色数小时至24h，取出水洗，吸干或烘干，镜检。 细菌呈蓝青色组织细胞胞浆呈红色细胞核呈蓝色(6)其他染色法芽孢染色法复红美蓝染色法孔雀绿-沙黄染色法 荚膜染色法美蓝染色法 瑞氏染色法或姬姆萨氏染色法 节氏（Jasmin）荚膜染色法 鞭毛染色法 莱氏（Leifson）鞭毛荚膜染色法刘荣标氏鞭毛染色法 卡-吉二氏（Casares-Cill）鞭毛染色法 银染法 异染颗粒染色法 美蓝染色法 亚氏（Albert）染色法 注意事项1在制备细菌抹片时，应注意无菌操作，尤其是接触到病原菌时，需防止细菌污染环境及操

15、作者。2细菌抹片玻片准备时，应注意是否有油渍。如有油渍应及时处理，否则玻片上的细菌抹片不能很好的均匀展开，将影响到细菌的观察。3细菌抹片制备后，应尽可能自然干燥。如果采用火焰干燥，不要过热，一般采用手背试，以不烫手为度。4细菌抹片的固定，应根据不同标本的抹片，采用不同的方法。一般纯培养物，常用火焰固定；而组织抹片常用化学方法固定。但瑞特氏染色法，不用专门固定，因为瑞特氏染色液中，已含有甲醇。5因在抹片中的固定，并不能保证杀死全部的细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分抹片冲脱。所以，对于一些感染性较强的病原菌，特别是带芽孢病原菌的抹片时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的

16、散播。 二、细菌的分离培养与鉴定 细菌等病原菌的分离及鉴定，使传染病诊断技术的基础，也是一项很基本的确诊方法。培养基的制备与无菌器材的准备细菌的分离培养与无菌操作接种技术细菌的生物化学试验血清学检测分子生物学鉴定(一)培养基的制备和无菌器材的准备1、培养基培养基是按照微生物的生长要求配制成的一种人工营养制品，主要作为繁殖细菌微生物、分离细菌微生物，鉴定细菌微生物、保存和研究细菌微生物以及制造生物制品等用。概念按来源分： 天然培养基 半合成培养基 合成培养基分类按物理性状分： 固体培养基 纯化，增菌 液体培养基 增菌 半固体培养基 动力检测，保种无动力 有动力半固体培养基（穿刺培养）固体培养基：

17、菌落，菌苔菌落: 指微生物细胞在一定条件下,在固体培养基表面形成的肉眼可见的微生物群体。若来自一个细胞,则为纯培养或称克隆。菌苔:大量细菌的菌落联成一片。液体培养基：表面生长 均匀混浊生长 沉淀生长 按用途分： 普通培养基 增菌培养基 鉴别培养基 选择培养基 厌氧培养基2、制备培养基培养基必须含有细菌所需的各种营养物质，如蛋白胨、碳水化合物及盐类。培养基必须含有合适的水分，因为细菌主要靠液体以弥散和渗透方式摄取营养。多数致病菌对酸碱值的变化均敏感，故所用的培养基需要调整pH值，通常为7.27.6。（1）培养基的制备要求制造的及分装培养基的容器不应含有抑制细菌生长繁殖的物质，制造时最好用搪瓷锅或

18、铝锅，不用通过或铁锅。制造培养所用的化学药品，均需化学纯以上，且各种成分要准确称量。制造的培养基应均质透明。培养基必须彻底灭菌，且应杂检。（2）制备培养基的操作步骤称量调pH、过滤加塞、包扎高压蒸汽灭菌溶解分装形成培养基杂菌检验冷藏待用称量按培养剂配方称好各种原料，培养基内用的试剂药品必须达到化学纯或分析纯，各种成分称量必须准确。溶解将各种成分按规定混合，加热溶解。调节pH值用酸度计，pH试纸或用氢离子浓度比色计来矫正pH值。(可用1molL NaOH或1molL HCl溶液进行调节)。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试

19、纸测试，直至达到所需pH为止，调整pH值到适宜的范围后，再加热煮沸1015min（注意补加液体的损耗）。过滤用滤纸或双层纱布(中间夹一层脱脂棉花)趁热过滤。分装 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管或三角烧瓶内。液体：分装以试管高度的1/4左右为宜。固体：每试管分装量为管高的1/5(灭菌后制成斜面)；分装三角烧瓶的量以不超过其1/2为宜。半固体：分装试管一般以管高度1/3为宜(灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂)。灭菌：高压蒸汽灭菌高压锅的构造及使用原理了解： 该法是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，加热使灭菌锅内的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气内的冷空气排尽后关闭排气阀，继续

20、加热，此时锅内温度逐步升，高于100 。在高温下，菌体蛋白质变性而达到灭菌的目的。附加：高压蒸汽灭菌灭菌操作步骤首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。排空冷气，使置于高压锅下层的物品达到设定的有效温度开启电源加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅

21、内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 1.05 kg/ cm2 ，121.3 ，20 min灭菌。灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。 如果压力未降到0时打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。形成培养基分装好的液体培养基，取出后冷却至温。分装好的半固体、斜面固体培养基，取出后按需要将试管斜置摆放，形成一定的角度，冷却至室温（如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应

22、垂直放置至冷凝）。平板的制作：将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50左右倾入无菌培养皿中，待冷凝。（温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50，培养基易于凝固而无法制作平板）平板的制作应在酒精灯旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入1012mL的培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。 杂菌检验，保存将上述冷凝后的培养基放入 37 温箱培养24 h，经检查若无杂菌生长，即可置于 4 冰箱冷藏，待用。 如果试验的精密度要求

23、不高， 一般情况下，无须进行杂菌检验。(3)培养基制作注意事项加热溶解过程中，要不断搅拌，以免琼脂或其他固体物质粘在烧杯底上烧焦，以致烧杯破裂。加热过程中所蒸发的水分应补足。pH值必须按各种不同培养基的要求准确矫正。所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿。分装培养基时，注意不得使培养基在瓶口或管壁上端沾染，以免引起杂菌污染。培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成分。 (二)细菌的分离培养 与 无菌操作接种技术病料的采集和运送病料处理细菌的分离与接种细菌的培养流 程无菌操作贯穿始终采样所用器械应事先消毒。对急性死亡的动物，从耳尖或四肢末梢血管取血制成

24、涂片，染色镜检，在排除炭疽后方能剖检取样。为了提高病原微生物的阳性分离率，采取的病料要尽可能齐全，除了内脏、淋巴结和局部病变组织外，还应采取脑组织和骨髓，以防遗漏。认真填写好病料送检单和剖检病理变化记录。病料的采集和运送1.3.细菌的分离与接种 在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少 的一环。 主要是在含许多细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。 选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。分离培养的目的分离培养时应注意(1)平板分段划线法操作前在平皿底面上用记号笔作好标记，如菌种、接种日期等，字体尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免

25、影响结果观察（标签如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。）另外，在平皿底面边缘作一划线标记。右手取接种环在火焰上灭菌，先将环端烧热，然后将接种环提起垂直放在火焰上，以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次。待烧灼的接种环冷却后，取一接种环带分离的细菌混合菌液。左手斜持(45度角)琼脂平板，略开盖，平板在酒精灯火焰左前上方约56cm距离。右手持已取标本的接种环在琼脂平板表面一侧涂布于培养基边缘，作为原划线。接种环烧灼灭菌，冷却后自原划线末端沾取少许标本，开始划线，接种环与

26、平板表面成3040角，运用腕力将接种环在平板上来回划线。划线要密但不能重叠，充分利用平板的表面积，不要划破琼脂表面，并注意无菌技术，避免空气中细菌的污染。也可用分区划线法，即从原划线末端沾取标本后只划平板的1/51/4，划毕烧灼灭菌接种环，待冷却后(可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却)，于第二段处再作划线，且在划线时与第一段的划线相交数点。待第二段划线完成时，再上述方法灭菌，冷却后同样划线，依次划至最后一段。接种环烧灼灭菌后方可放下。将培养皿倒置(平板底部朝上)于37温箱中，培养一定时间后取出观察结果。 注意事项 在分离培养之前观察菌落时，不要将空气中落入培养基而生长的杂菌误认为目的细菌。

27、杂菌一般生长于划线痕迹外，或为个别的形状异常的孤立菌落。另外观察时，也要注意保护好平板，勿使再落入杂菌。还应注意下列事项：选择适合于所分离细菌生长的培养基。病原细菌培养温度一般在37。考虑所分离的细菌是需氧性或厌氧性，决定培养条件。初代分离时发现有多种细菌，应进一步选择可疑菌落进行纯培养。划线时先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。划线中不宜过多重复旧线，以免形成菌苔。 (2)平板涂布培养法在培养基的平板底面分别用记号笔标明待接种的菌种名称、稀释度、日期和接种者。用无菌吸管吸取0.1mL待分离菌液，小心滴在平板培养基表面中央位置(0.1mL的菌液要全部滴在培养基上，若吸

28、管尖端有剩余的，需将吸管在培养基表面上轻轻地按一下便可)。右手拿无菌涂棒，平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。室温下静置510min，使菌液吸附进培养基。将培养基平板倒置于37温箱中培养一定时间后，观察结果。(3)倾注平板法取6支无菌试管，标明1、2、3、4、5和6号码。用无菌吸管分别吸取无菌生理盐水于6支试管中，每管9.9mL。用一支1mL无菌吸管吸取待分离菌液0.1mL，加入1号试管中，用吸管吹取3次，使之混合均匀。然后用无菌吸管从此试管中吸取0.1mL混合菌液(无菌操)，加入2

29、号试管中混合均匀，依此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6不同稀释度的混合菌稀释液。取灭菌的空平皿分别在底面用记号笔写上10-4、10-5和10-63个稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管混合菌稀释液中各吸取0.1mL，对号放入已写好稀释度的空平皿中，每一平皿内倾入适量已融化且冷至4550左右的普通营养琼脂培养基，迅速将平皿轻轻前后左右摇动，使稀释液与融化琼脂均匀混合。然后平放于桌上，静置，待冷后倒置于37温箱培养一定时间后，观察结果。(4)斜面培养基接种法在斜面培养基试管上用记号笔标明待接种的菌种名称、日期和接种者。点燃酒精灯。将菌种试管

30、和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，试管底部放在手掌内并将中指夹在两试管之间，使斜面向上成水平状态，在火焰边用右手松动试管塞以利于接种时拔出。右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌(参照平板分段划线法)，在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞(或试管帽)将其取出，并迅速烧灼管口。 将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，使接种环的温度下降达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划一直线，再从斜面底部向上轻轻曲折连续划线。接种环退出斜面试管，再用火焰烧灼管口，并

31、在火焰边将试管塞上。将接种环逐渐接近火焰再烧灼，如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在火焰边烤干，然后再烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出，污染环境，接种病原菌时更要注意此点。将接种物于37温箱中培养一定时间后，观察结果。注意事项取试管棉塞或管帽时要缓慢拔出，不宜用力过猛。所划直线尽可能的直，切莫划几条直线或蛇行，不要将培养基划破，也不要使接种环接触管壁或管口。 (5)液体培养基接种法在接种的试管上用记号笔标明待接种的菌种名称、日期和接种者。参照斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的肉汤管。右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌(参照平板分段划线法)，在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞(或

32、试管帽)将其取出，并迅速烧灼管口。接种环灭菌冷却后，伸入接种管挑取少许菌苔退出菌种管，再伸入肉汤管，在液体表面处的管内壁上轻轻磨擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。接种完毕，重新灭菌接种环，塞好棉塞（或试管帽），放37温箱培养。接种物若为液体培养物，则可用无菌吸管定量吸出后加入或直接倒入液体培养基。若向液体培养基中接种量大或要求定量接种时，可先将无菌水或液体培养基加入菌种试管，用接种环将菌苔刮下制成菌悬液(刮菌苔时要逐步从上向下将菌苔洗下，用手或振荡器振匀)。将接种物于37温箱中培养，观察结果。注意事项取试管棉塞或管帽时要缓慢拔出，不宜用力过猛。塞好试管塞，完成接种后摇动试管，使菌体在

33、培养液中分布均匀。整个接种过程都要无菌操作。(6)半固体穿刺接种法在接种的试管上用记号笔标明待接种的菌种名称、日期和接种者。参照斜面培养基接种法握持接种的半固体培养基。右手拿接种针通过火焰烧灼灭菌(参照平板分段划线法)，在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞(或试管帽)将其取出，并迅速烧灼管口。接种时先将接种针灭菌冷却，挑取菌落，而后垂直穿入半固体培养基中心接近试管底部，但注意不可穿至管底，然后迅速沿原路退出。灭菌接种针，塞好棉塞（或试管帽），放37温箱中，培养24h后取出观察结果。注意事项 接种针垂直穿入半固体培养基中心接近试管底部，但注意不可穿至管底，沿原路退出。4.细菌

34、培养方法(1)一般培养法 又称需氧培养法，将已接种好标本的各种培养基，置37温箱中培养1824h，一般细菌即可于培养基上生长。但菌量很少或难于生长的细菌需培养37d甚至1个月。猪链球菌在羊血平板上的菌落形态霍乱弧菌在TCBS的平板上的菌落特征伤寒沙门菌在CHROM agar显色培养基上的菌落特征梭菌在CCFA培养基上的生长特性布鲁氏菌的菌落炭疽芽孢杆菌的菌落鼠疫耶氏菌菌落禽霍乱菌菌落 枯草芽胞杆菌菌落 链球菌的溶血环(2)二氧化碳培养法 是将某些细菌，如布鲁杆菌，于CO2环境中进行培养。常用的产生CO2的方法有烛缸法和化学法。烛缸法：将已接种细菌的平板置于容量为2 000mL的干燥器内(为了隔

35、绝空气，缸盖及缸口涂以凡士林)，放入小段点燃的蜡烛于缸内，盖密缸盖。缸内燃烛约于0.51min后因缺氧自行熄灭，此时容器内二氧化碳含量约为510。将干燥器置于37温箱中培养。化学法(重碳酸钠盐酸法)：将已接种细菌的平板置于干燥器内。取一容器（或平皿），按干燥器的容积分别加入重碳酸钠0.4g/L与浓盐酸0.35mL/L，两者不接触，将此容器(或平皿)放入干燥器内。盖紧缸盖后倾斜容器，使盐酸与重碳酸钠接触生成CO2。CO2培养箱法：按常规方法，采用CO2培养箱培养。 (3)厌氧性细菌的培养法庖肉培养基法：将盖在培养基液面的石蜡凡士林先于火焰上微微加热，使其边缘溶化，再用接种环将石蜡凡士林块拨成斜立

36、或直立在液面上，然后用接种环或无菌滴管接种。接种后再将液面上的石蜡凡士林块在火焰上加热使其融化，然后将试管直立静置，使石蜡凡士林凝固并密封培养基液面。破伤风梭菌 产气荚膜梭菌 正常对照 碱性焦性没食子酸法大管套小管法：取1支已灭菌、带橡皮塞的大试管，放入少许棉花和焦性没食子酸。焦性没食子酸的用量按它在过量碱液中能每克吸收100mL空气中的氧来估计。取1支小试管琼脂斜面，接种产气荚膜梭菌、葡萄球菌。在大试管内迅速滴入10的NaOH，使焦性没食子酸湿润，并立即将除掉棉塞已接种厌氧菌的小试管斜面(小试管口朝上)放入大试管中，塞上橡皮塞，如图4-5，37培养，定期观察斜面上菌种的生长状况并记录。培养皿

37、法：取玻璃板一块或培养皿盖，洗净，干燥后灭菌。铺上一薄层灭菌脱脂棉或纱布，将1g焦性没食子酸放在其上。在培养基平板上一半划线接种产气荚膜梭菌，另一半划线接种葡萄球菌，并在皿底用记号笔作好标记。滴加10NaOH溶液约2mL于焦性没食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即将已接种的平板覆盖于玻璃板上或培养皿盖上，必须将脱脂棉全部罩住，而焦性没食子酸反应物不能与培养基表面接触，如图4-6。以溶化的石蜡凡士林液密封皿底与玻板或皿盖的接触处，置37培养，定期观察平板上菌种的生长状况并记录。 焦性没食子酸培养基焦性没食子酸培养基示意图石蜡血平板纱布产气荚膜梭菌血平板厌氧培养 结果观察 厌氧生物袋法 用肉膏蛋白胨

38、琼脂培养基倒制平板，凝固干燥后，平板划线接种产气荚膜梭菌和葡萄球菌，并作好标记。接种好的平板放入袋中，排出袋中气体，卷叠好袋口，用弹簧夹夹紧，然后折断气体发生小管中安瓿，使发生反应产生CO2、H2等。在催化剂钯的作用下，H2与袋中剩余O2生成H2O，使袋内环境达到无氧。约30min后，再折断美蓝液安瓿(美蓝在无氧环境中无色，在有氧环境中变成蓝色)，如指示剂不变蓝，表示袋内已成无氧环境，此时即可放人37温箱中培养，观察并记录菌种生长情况。厌氧培养箱法 它是将需厌氧培养的培养物置厌氧培养箱内进行培养。厌氧培养箱是目前较为先进的厌氧培养装置,由手套操作箱及传递箱两个主要部分组成，适用于在无氧环境中连

39、续进行标本接种、培养和鉴定等全部工作。手套操作箱是用塑料制成的，有两个门，个与操作箱连结，一个可与外部相通，起缓冲作用，以保持操作箱内的无氧环境不变。标本和实验器材通过此处进出操作箱。由外向内传递物品时，先将内侧门关严，物品进入传递箱之后，关闭外侧门。用真空泵排气减压，充入氮气。重复排气一次，氧可被排除99以上。通过手套用手打开侧门，无氧混合气体从操作箱自动流入传递箱，恢复正常(详见“常用仪器之厌氧培养箱”)。 5.注意事项（1）烛缸培养法培养细菌时，缸内点燃的蜡烛勿靠近缸壁，以免烤热缸壁而炸裂。（2）配好的庖肉培养基试管若已放置了一段时间，则接种前应将其置沸水浴中再加热10min，以除去溶入的氧。而刚灭完菌的新鲜庖肉培养基可先接种后再用石蜡凡士林封闭液面，这样可避免一些操作上的麻烦。在用火焰融化培养基液面上的石蜡凡士林时，应注意不要使下面的培养基的温度升得太高，以免烫死刚接入的菌种。（3）对于一般的厌氧菌，接种后的庖肉培养基可直接放在温室里培养。而对于一些对厌氧环境要求比较苛刻的厌氧菌，接种后的庖肉培养基应先放在厌氧罐中，然后再送温室培养。（4）焦性没食子酸遇碱性溶液后即会迅速发生反应并开始吸氧，所以在采用此法进行厌氧微生物培养时，必需注意只有在一切