单抗的制备方法(实验室Protocol)

1、单抗的制备方法免疫BALB/C小鼠的免疫BALB/C小鼠的免疫按常规方法进行，二免后一个星期分别用断尾抽真空法采血200PL进行抗体检测，二免采血后让小鼠休息两周进行加强免疫，三天后融合。表1BALB/c小鼠的免疫方案（供参考免疫次数时间免疫剂量（pg/mL）免疫方法佐剂首免0d100颈背部皮F弗氏完全佐剂二免21d100腹腔注射兆氏不完全佐加强42d（融合前三200腹腔注射剂天）不加佐剂BALB/c小鼠的抗体检测2.1BALB/c小鼠血清的制备将采集的全血样品于37C温箱放置30min后，4C放置半天，待血清析出后，4500i7min,离心lOinin,用移液器吸岀血清，4C放置待检。2.2

2、间接ELISA法的建立BALB/c小鼠免疫后，用间接ELISA法対其血清抗体水平进行检测，间接ELISA法步骤如下：包被：4C包被过夜。洗板：弃去包被液，拍干，向酶标板内加入洗涤液，每孔200j.iL,35min后倒掉洗涤液，再拍干。如此重复三次。加待检血清：将血清用ELISA洗涤液从1：10000开始进行倍比稀释（即1：10000、20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000）,共8个浓度。将稀释好的血清按浓度宙低至高的顺序加入酶标板内，每孔lOOpL,每只小鼠的血清做两列，在37C温箱内孵育30min。同时设阴性血清対照。洗板：同上。加HRP

3、标二抗：工作浓度1：10000,每孔100j.iL,在37C温箱内孵育30min后，洗板三次。显色：加底物（TMB-iS氧化MK）,每孔lOOpL,37C温箱放置10min,加2mol/LH.SO,终止显色反应，每孔50pL,用酶标仪测定OD值。24450结果判定：P.2,判为阳性（P、N分别为待检和阴性血清的OD值）。4502.3SP2/0骨髓瘤的复苏当血清效价高于1：10000时，开始复苏瘤细胞并注射一只BALB/C小鼠，过程如下：将装右SP2/0骨髓瘤细胞的纱布袋从液氮罐中取出，用止血钳夹出一管，将纱布袋放回液氮罐，用止血钳夹着装有SP2/0骨髓瘤细胞的冻存管在37C水浴中转动，肖到细胞

4、解冻，用RPMI-1640基础培养液10mL,1200i7min,5min,洗细胞两次，用8mL完全培养液将细胞巫悬后加入培养瓶中，在CO,恒温培养箱中培养。待SP2/0骨尚瘤2细胞长满瓶底（培养3天左右），将细胞吹洗下来，离心去上清，用lmL上清将细胞重悬，取0.5mL注射到BALB/c小鼠颈背部皮下，一周后开始观察注射部位是否有瘤子长出。待到瘤子长到金豆大小时（9天左右），对BALE/c小鼠进行加强免疫，三天后做融合。2.4细胞融合与培养2.4.1细胞融合器材与试剂的准备小剪刀、小毀子（各10套）：用酒精棉球擦过后，晾于，装入小铝盒灭菌；玻璃匀浆器（至少三套）：检查是否破损、配套，装盒灭菌

5、；玻璃吸管10mL、5mL（用定制的铝盒盛装，至少各一盒，约40支），lmL（l支）用报纸卷好灭菌；linL注射器（1支，用报纸包好）和7号针头（用小铝盒装）灭菌，抽取HAT用；50mL离心管：4支，装少量三蒸水，包上报纸，用橡皮筋扎好，再把盖拧松,装入500niL烧杯，用纱布盖口，灭菌；吸水纸：剪成10cm见方的小块（若干张），用报纸包好，灭菌，细胞融合时控干水滴用；无菌96孔板四块；血球记数板1块；lOOinL葡萄糖瓶（2个）灭菌，一个用来装饲养细胞，另一个用来装501HLRPMI-1640基础培养液并提前温育到37C；泡沫板一块：15cmx25cm,解剖小鼠用；RPMI-1640基础培养

6、液1瓶；RPMI-1640培养完全液1瓶;HAT（lOOx）；50%PEG-1450用冻存管分装成每管0.83111L后，4C保存，融合当天取一管置COJH温2培养箱内温育至37C,备用。2.4.2饲养细胞的制备在制备饲养细胞时，本实验室采用BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞和脾细胞的混合细胞作为饲养细胞，其制备步骤如下：脱颈椎处死空白BALB/c小鼠1只，用75%的酒精浸泡5mino于超净工作台内，将小鼠腹部朝上，用针头将4个脚学固定在垫有灭菌报纸的泡沫板上。用止血钳（酒精灯火焰烧过）从铝盒中夹出一套小剪刀和小银子，用小钱子夹紧小鼠下腹部皮肤并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一小口，将剪刀尖从小

7、口伸进去，打开剪刀将小口向两边撑开并向下按住小鼠的两后肢，将小银子从撑开的小口伸进去，夹紧并挂住剪开的皮肤向前撕扯，直到胸腹部完全暴露出来。换一套小剪刀和銀子，用小銀子在小鼠腹中部捏住腹膜并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一3mm左右的小口，将小銀子搁在腹膜上，小剪刀搁在小铝盒盖沿备用。用5mL吸管吸取2.5inLRPMI-1640础培养液，小锻子提起腹膜，吸管尖从剪开的小口伸进去，将培养液注入小鼠的腹腔，吹吸数次后，将培养液吸出转移到50mL离心管中，如此重复一次。将小鼠两后肢交叉固定（左后肢在上以便于脾脏的暴露），用小铁子在远离脾脏的部位捏住腹膜并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一小口，将

8、剪刀尖从小口伸进去,三天后做融合。2.4.3SP2/0骨髓瘤细胞的制备本实验室将BALB/C小鼠体内生长的SP2/0骨髓瘤匀浆后制备SP2/0骨髓瘤细胞，然后再用于融合，其制备步骤如下：将背部皮下长出骨髓瘤的BALB/c小鼠脱颈椎处死，用75%的酒精辱盗mA、在一支灭菌50mL离心管中事先加入15mL淋巴细胞分离液。背部朝上固电小鼠，参照饲养细胞的制备方法，分离骨髓瘤（只要蚕豆大小的一块瘤子即够做一姻合少匀浆制备骨髓瘤细胞。取15mL骨髓瘤细胞悬液轻轻加到淋巴细胞分离液湖玄注意：要保证两种液体呈分层状态，千力不能将液体混匀。1700r/inin,水平离心10min后，取出离心管可见，在骨髓瘤细

9、胞悬液和淋巴细胞分离液的交界处仃一层白色的细胞，这就是骨髓瘤细胞，用10mL吸管吸走上层细胞悬液后，将中层的骨髓瘤细胞悬液转移到另一支灭菌50mL离心管中，用15mLRPMI-1640ffi础培养液，1200r/miii,5min洗细胞两次。用10mLRPMI1640煎础培养液巫悬骨髓瘤细胞，用4血球计数板计数。骨髓瘤细胞浓度=（四角+中央中方格的细胞数）x5xl0个/毫升2.4.4免疫睥细胞的制备将免疫小鼠的脾细胞分离出来并匀浆制备免疫睥细胞，其方法同2.2.2.6.2饲养细胞制备时脾细胞的制备，只是免疫过的脾脏被大量结缔组织包裹分离起来比正常脾脏困难一些，如果不能完整的分离，可以分小块分离

10、。2.4.5免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合本实验室用分子量为1450的50%PEG作融合剂进行细胞融合，细胞融合按常规方法进行，其操作步骤如下：7取1x10个SP2/0骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合，用15mLRPMI-1640基础培养液巫悬，1500r/min,5min洗细胞两次。于超净工作台内取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合细胞的50mL离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴。用小铝锅装2/3容积的水，于电炉上加热到37C后放进超净工作台；从CO,培养箱取出温育至37C的50%PEG,用1mL的吸管吸取0.8inL,手持装有混合细胞的50mL离心管，将其放置于37C

11、水浴小铝锅中，将PEG缓缓加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，持续90Sec后，将离心管插到离心管架上，移走小铝锅,从CO,培养箱取出温育至37C的50niLRPMI-1640棊础培养液，用吸管吸取10inL缓缓加到融合细胞上边加边轻轻搅拌（千丿j不能吹打），使细胞团块分散，先加1111L,再加2mL,再加3mL,放后加完剩下的4mL,加完第一个10mL后，接着沿管壁加完剩下的40mL,加完后，拧紧盖，反复颠倒儿次，使细胞混匀。1500Wmim离心5min,弃上清，用巫悬有饲养细胞的72inL含1%HAT的RPMI-1640完全培养液将融合细胞亜悬。注：动作要轻，将用吸管将细胞轻轻搅拌起来，不要吹

12、打。将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置CO培养箱培养。融合后第4天即口J观察到小集落；第7天补加含1%HT的RPMI-1640完全培养液1滴/孔;第10天左右，集落长到占孔底1/4大小，培养液变黃，即可进行抗体检测。2.5阳性孔的筛选2.5.1集落孔的标记融合后第7天，在倒置显微镜下对培养板进行观察，在有集落出现孔的培养板盖上方用记号笔打上小点，标明集落的位置，以便检测时取样以及原始孔的对号入座。2.5.2筛选采用间接ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选。2.5.3杂交瘤细胞的克隆（有限稀释法）克隆采用有限稀释法进行，具体过程如下：饲养细胞的制备：1只BALB/

13、C小鼠的腹腔巨噬细胞和脾细胞口J铺46块96孔细胞培养板，放好只铺4块。铺24孔板时，4滴/孔，所用饲养细胞量和96孔细胞培养板相当。于超净工作台内取岀若干灭菌小青霉索瓶，两个一组摆成两列（每个待克隆孔需两个小青霉索瓶），其中一列每瓶加3.8inL含0.5%HT的RPMI-1640完全培养液，另一列每瓶加6.21I1L；取出若干灭菌1.5inL离心管，四个一列摆成若干列（每个待克隆孔用一列）。以后的克隆均使用不含HT的RPMI-1640完全培养液。稀释：用剪断尖端的100pL枪头在待克隆孔内吹打数次使细胞重悬起来，用血球计数板对细胞计数，用移液器取100pL加到第1个1.5inL离心管中。细胞

14、浓度=25个中方格的细胞总数xio个/毫升。细胞浓度一般在10数量级。在第1个1.5m（n3离心管内将细胞稀释成1x10个/毫升,再将细胞进行10 x稀释，直到细胞浓度为1x103个/毫升。将1x10个/毫升浓度的细胞取200pL加到装有3.8inL培养液的小青霉索瓶中（细胞浓度为50个/毫升），混匀后，取0.7111L加到装右6.2111L培养液的小青霉索瓶中（细胞浓度约为5个/毫升）。先将浓度约为5个/毫升的细胞加到铺好饲养细胞96孔培养板的前8列，在将浓度约为50个/毫升的细胞加到同一块96孔培养板的后4列，每孔1OOgLo加完置CO,培养箱培养。一般克隆后第4天即町见到小集落，第7天补

15、液，第9左右进行抗体检测，准备进行第2次克隆。克隆一般要进行3次克隆，直到岀现集落孔的阳性率为100%。2.5.4小鼠腹水法生产单克隆抗体本实验室采用灭菌液体右蜡预处理BALB/C小鼠后，再注射杂交瘤细胞的方法生产腹水，其具体过程如下：BALB/c小鼠的预处理：用灭菌的液体和蜡处理小鼠，腹腔注射0.5mL/只，讣天后即可注射杂交瘤细胞。阳性孔的扩大培养：在24孔细胞培养板加入饲养细胞，4滴/孔，将96孔板内的阳性细胞转到24孔细胞培养板进行扩大培养。注射：待到细胞长满孔底将24孔板的细胞1200r/min,离心5min,细胞6计数，用RPMI-1640础培养液稀释成15x10个/毫升，腹腔注射

16、小鼠0.5mL/只,8天左右观察到小鼠腹部隆起，即町采集腹水。2.5.5细胞的冻存与复苏在杂交瘤细胞进行扩大培养后，应该冻存一部分细胞。采集腹水后还应该用淋巴细胞分离液将杂交瘤细胞分离出來再冻存一部分。细胞冻存儿个月后耍进行复苏，对细胞活力和分泌抗体的能力进行检测。细胞冻存和复苏的具体方法如下：用RPMI-1640基础培养液将杂交瘤细胞重悬，1200i7min,离心5min,洗细胞两次，弃上清，用细胞冻存液将细胞重悬，用血球计数板对细胞进行计数，使细胞6浓度在15x10个/毫升范围内，将细胞转入冻存管，每管1.5111L,放进H制的双层小纱布袋，6管/袋，先置液氮罐上气相或26C冰箱30min

17、,再置液氮罐下气相过夜，最后将小纱布袋浸入液氮中长期保存。细胞复苏方法同1.2.2.5瘤细胞复苏。对细胞活力和分泌抗体的能力进行检测。细胞冻存和复苏的具体方法如下：用RPMI-1640基础培养液将杂交瘤细胞重悬，1200r/min,离心5min,洗细胞两次，弃上清，用细胞冻存液将细胞車悬，用血球计数板对细胞进行计数，使细胞6浓度在15x10个/毫升范围内，将细胞转入冻存管，每管1.5mL,放进口制的双层小纱布袋，6管/袋，先置液氮罐上气相或26C冰箱30min,再置液氮罐下气相过夜，最后将小纱布袋浸入液氮中长期保存。细胞复苏方法同122.5瘤细胞复苏労单克隆抗体的鉴定3.1杂交瘤细胞染色体数的

18、检测在细胞传代培养48h后加入秋水仙索，使其瑕终浓度达到0.04pgmL,继续培养2.02.5ho终止培养后，将贴壁的细胞全部用吸管吹下，移入10mL的离心管，以1OOOr/niin离心lOmin,弃去上清液。加入37C预温的0.075mol/L的KCL低渗溶液5.0mL,用吸管吹打均匀，置37C水浴15min20min。每管加入新鲜配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3：l）1.0inL混匀，以100017mm离心lOinin,去上清。再每管加固定液5.0111L,轻轻混匀，静止30miiiJS,以1OOOr/min离心lOmin,弃上清。再次I占j定，加固定液5.0mL,轻轻混匀静止30min,以

19、10001/min离心lOmiii,弃上清,用同样方法加固定液5.0mL打匀，封上管口于4C静止过夜。轻轻吸去上清液，留下0.5inL左右的上清液，混匀使细胞悬浮，用滴管吸取细胞悬液23滴，滴在已用冰水浸泡的洁净的载玻片上，立即吹散，并在火焰上通过儿次，促使细胞平铺于载玻片上，口然干燥。以10%Giemsa染液染色lOinin,洗去洗液口然干燥。最后于显微镜下观察计数。3.2单克隆抗体亚型的鉴定釆用HBT公司的鼠源单抗亚类鉴定试剂盒（MouseMabisotypingKit）对单克隆抗体亚型进行鉴定，操作过程如下：将试剂盒内的缓冲液温育到37C,加500pL缓冲液到装有分型试纸卡（k轻链）的小

20、试管内。加500yL样品（培养上清或稀释过的腹水，一般用PBS做1000倍稀释）,轻轻晃动小试管使试纸卡充分浸没。摇动装右大鼠抗小鼠K轻链抗体一胶体结合物的试剂瓶（大瓶），混匀后，取ImL加到小试管，保持试纸卡有字一而朝下。在1825C晃动小试管，直到两个小点出现（車链同种型和K轻链）。在晃动的过程中要始终保持试纸卡浸没在溶液中，而且有字一而朝下。3.3单克隆抗体电泳鉴定将饱和硫酸钱粗提的单抗、葡聚糖凝胶G-200纯化的单抗以及蛋白质Marker用浓度为12%的分离胶进行SDS,对单抗的蛋白质本质加以鉴定，并验证G-200纯化效果。单克隆抗体的纯化4.1硫酸钱盐析法纯化单克隆抗体（少最提取）腹

21、水的预处理（二氧化硅吸附法）：取一定量的腹水，加等体积的巴比妥缓冲液,加适量二氧化硅粉末，室温下，搅拌30min,然后1800i7min,清的腹水。用50%的饱和硫酸钱（按最终饱和度算）粗提一次，33%的饱和硫酸钱粗提两次,用1/2腹水体积的PBS将单抗溶解，装入透析袋，用PES透析两天，用小青霉索瓶分装，每瓶2mL,冻干，于26C保存。使用时用2mL蒸馆水溶解。葡聚糖凝胶G-200纯化单抗：将葡聚糖凝胶G-200用PES于4C浸泡三天，装柱，将粗提的单抗取lmL上样，用PES洗脱，20%磺基水杨酸检测，出现白色浑浊后开始收集，浑浊度较低时停止收集。用小青霉索瓶分装成每瓶2mL,冻十，于26C

22、保存。4.2辛酸-硫酸钱盐析法纯化单克隆抗体（大量提取）辛酸硫酸鞍盐析法是一个经验的方法，辛酸在偏酸条件下能将血清中除IgG外的蛋白质都沉淀下来，上清中只有IgGo辛酸加入量因抗体的来源不同而不同，人血清为70|.d/mL,兔血清中为75gl/mL,小鼠血清为4Opl/mL,小鼠腹水为33pl/mL。这种方法IgG的回收率可达90%,具体操作如下：向一份预处理过的腹水中加入2份0.06mol/mL、pH5.0的乙酸缓冲液，用O.lmol/niL的HC1调pH至4.5。于室温搅拌下在30min内逐滴缓慢加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33pL,4C静置2h,15OOOr/niiii离心30min

23、,弃沉淀。上清经砂芯漏斗或125pm的尼龙网过滤，加入1/10体积的0.1mol/LPB（pH7.4）、8.5%NaCl（用lmol/L的NaOH调pH至7.4）。在4C冰浴下于30min内加入0.277助血的硫酸鞍，使成45%饱和度，静置lh以上。4C下12000r/min离心30min,弃上清。沉淀溶于适量137mmol/LNaCl、2.6imnol/LKC1、0.2minol/LEDTA的PBS（pH7.4）中,对50100倍的上述PES于4C透析过夜。4C下12000r/min离心30min,除去不溶性沉渣。该法主要用于IgG2b和IgGl的纯化，对IgA和IgG3的回收率及纯化效果都较差。辛酸硫酸钱盐析法纯化单克隆抗体可获得95%的纯度，其中鼠IgG纯度达98%以上。附录：所用试剂及溶液:细胞培养溶液双抗：取青霉索G钠100丿j单位和硫酸庆大霉索lg溶于lOOmL三蒸水，过滤除菌后分装小青霉索瓶，于26C保存。基础培养液：RPMI-1640粉剂一袋，补加2.0g碳酸氢钠（NaHCOp,于