硕士论文开题报告-

1、牦牛初乳中抗菌作用相关基因的克隆与表达 学科专业： 指导教师： 报告人：1开题内容一、研究意义和国内外现状二、主要研究内容三、研究方法四、技术路线五、论文特色和创新点六、年度计划七、经费预算 21、项目的研究意义与国内外研究现 状述评哺乳动物初乳中含有大量的生物活性物质，包括多种免疫球蛋白、非抗体保护蛋白、酪蛋白源生物活性肽等。其中溶菌酶（Lysozyme）、转铁蛋白（Transferrin,Tf）等蛋白质具有明显的抗菌活性，并且是新生动物必需的营养调节物质。从牦牛幼畜疾病控制的角度考虑，在饲料中添加乳源的抗菌物质可能成为控制养殖环节中幼犊死亡的关键技术之一。目前，已成功将人乳腺中的Lysoz

2、yme基因转入水稻，并将转基因水稻生产的米粉作为防止婴儿腹泻的营养食品。因此，通过日粮添加基因工程方法生产的Lysozyme、Tf可望解决牦牛幼犊腹泻导致死亡的问题。32、本课题研究的主要思想，主要观 点，主要内容，重点和难点分析 2.1 研究的主要思想观点和目标：克隆牦牛乳腺中的Lysozme 和Tf全基因和其cDNA序列；获得 转Lysozme 和Tf基因的基因工程菌；获得转Lysozme 和Tf基因的酵母基因工程菌。亲和层析法分离重组的Lysozme 和Tf并进行抗菌和犊牦牛的饲养实验。4研究的主要内容2.2.1 Lysozme 、Tf基因克隆 根据黄牛的Lysozme 、Tf基因cDN

3、A序 列设计PCR引物 牦牛Lysozme、Tf基因的克隆和全长cDNA的获得和鉴定2.2.2 Lysozme和Tf在中的异源表达2.2.3 Lysozme和Tf在酵母中的异源表达52.2.4 Lysozme 、LFc和Tf重组蛋白的分离纯化 采用亲合层析法从基因工程菌中分离纯 化Lysozme和Tf 表达产物的分离纯化及抗菌机理研究2.2.5 Lysozme 、Tf对犊牦牛的营养作用机理研究 Lysozme 、Tf对犊牦牛肠道形态学及微 生物 菌群的影响 Lysozme 、Tf和对犊牦牛生长性能及免疫指标 的影响62.3 拟解决的关键问题:本项目中存在三个关键的技术问题全长cDNA的获得由于

4、普通牛的Lysozme、Tf基因已经被克隆,因此可采用PCR或RT-PCR的方法获得2个基因的cDNA序列或全基因序列。为获得全长cDNA 序列我们准备采用Clontech 公司的Smart cDNA合成技术得到全长cDNA。其特点是采用了一种名为superscript 的逆转录酶。 7高效异源表达系统载体的构建由于Lysozme 、Tf均为真核生物的基因，其蛋白上有许多修饰基团，因此在表达该蛋白时采用真核表达系统是适宜的。解决问题的方法是除用大肠杆菌的pET载体进行表达外，还将Lysozme 、Tf基因在酵母用pPICZA载体载体进行表达。8异源表达的Lysozme和Tf抑菌和抗菌效果 异源

5、表达的Lysozme和Tf 是否具有抑菌和抗菌效果是本项目的关键之一，因此当表达产物的抑菌和抗菌活性较低或不具有抑菌和抗菌效果时，可更换不同的表达系统。93、研究方法乳腺组织总DNA和mRNA的制备：采用常规方法进行。全长cDNA的合成用Clontech 公司的SMART 技术合成。Lysozme 、Tf基因序列的获得采用PCR方法，相应基因的cDNA序列通过RT-PCR方法获得。Lysozme 和Tf的cDNA采用 pET-32载体构建失控型载体在进行原核表达。10Lysozme 、Tf的cDNA采用毕赤酵母的pPICZA载体进行表达。Lysozme和Tf的抗菌和饲养实验按按常规方法进行。4

6、 技术线路和实验方案总技术路线11 采样牦牛 12 初乳期乳腺组织 常乳期乳腺组织 分离mRNA 分离mRNA 全长cDNA的获得 全长cDNA的获得 RT-PCR克隆牦牛Lysozme和Tf的cDNA 与T载体的连接 序列测定 与E.coli pET载体的连接 与Yeast pPICZA载体的连接 基因工程重组菌的筛选 基因工程重组菌的筛选 异源表达蛋白的分离纯化 异源表达蛋白的分离化 Lysozme 、Tf抗菌机理的研究 犊牦牛饲养效果研究 大肠杆菌 沙门氏菌 痢疾杆菌 免疫指标 肠道形态学及微生物菌群 134.2 Lysozme和Tf的cDNA在大肠杆 菌中的表达 cDNA的合成 重组载

7、体的构建 转化大肠杆菌 阳性克隆的分离鉴定 基因工程菌的发酵与培养 重组蛋白的分离与纯化 重组蛋白与天然蛋白的抗菌抑菌试验14TFBamH1BamH1Xho1Xho1连接酶154.3 Lysozme 、Tf的cDNA在酵母菌 中的表达 Lysozme 、Tf全基因的合成（引入酶切位点） 酶切 酶切 连接转化 鉴定阳性克隆、测序 电转化酵母 鉴定阳性克隆 感受态细胞抗菌实验 蛋白纯化 SDSWestern-blot 摇瓶发酵培养 及定量 165 本项目的特色与创新之处首次通过分子生物学方法克隆牦牛Lysozme 、Tf基因。首次构建牦牛Lysozme 和Tf基因的大肠杆菌基因工程菌。研究重组蛋白对大肠杆菌、沙门氏菌等的抗菌效果。通过在日粮中添加重组Lysozme和Tf 蛋白研究其抗菌效果，并研究其对犊牦牛的营养机理。对重组的Lysozme和Tf添加到犊牦牛日粮的可行性进行研究，探讨通过现代生物技术提高犊牦牛生长潜力的可能性。本项目如获成功，可能具有较大的应用价值 。176 年度计划2007年 1、选题和资料收集 2、文献整理、阅读以及实验方案的设计 3、采样、提取RNA、合成cDNA182008年 1、完成Lysozme 、Tf基因在大肠杆菌和酵母菌中的表达。2