生物化学A（上）-5蛋白质三级结构-分离提纯

1、蛋白质2014年3月17日蛋白质结构的层次 一级结构：氨基酸序列 二级结构：螺旋，折叠 超二级结构 Module, Motif domain（结构域） 三级结构：所有原子空间位置 四级结构：蛋白质多聚体肽链中的肽平面蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ) - 螺 旋 的 特 性氢键取向与主轴基本平行右旋，3.6个氨基酸一个周期，螺距0.54 nm第n个AA(NH)与第n-4个 AA(CO)形成氢键，环内原子数13。氨基酸残基侧链可影响-螺旋的形成在多肽链中连续的出现带同种电荷的极

2、性氨基酸，-螺旋就不稳定。在多肽链中只要出现pro，-螺旋就被中断,产生一个弯曲（bend）或结节（kink）。Gly的R基太小，难以形成-螺旋所需的两面角，所以和Pro一样也是螺旋的最大破坏者。肽链中连续出现带庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成-螺旋。 -折叠的特点： 与-螺旋结构完全不同，呈折纸状。-折叠多肽链充分伸展，每个肽单元以C为旋转点，依次折叠为锯齿状结构，氨基酸侧链交替地位于锯齿状结构上下方 在两条相邻的肽链之间形成氢链。 -折叠有平行和反平行的两种形式: 每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是0.325nm，反平行的是0.35nm。 -转角（-turn）-转角

3、: 是多肽链180回折部分所形成的一种二级结构，通常有4个氨基酸残基组成,其第1个残基的羰基氧(O)与第4个残基的氨基(H)可形成氢键。细胞色素C的三级结构无规则卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构，但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里。无规卷曲(Random coil)超二级结构是1973年Rossmann提出的，它是指二级结构的基本结构单位（-螺旋，-折叠等）相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。主要有、 、等。细胞色素C的结构 细胞核抗原的结构 纤溶酶原的结构 超二级结构Up and down BarrelGFP-barrel with Greek key sheet form

4、ed structureMotifDomain蛋白质的三级结构蛋白质每个原子的空间位置，其主要研究方法是X-光衍射和核磁共振法。蛋白质的一级结构决定其三级结构。换言之，蛋白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。Anfinsen （1972诺贝尔奖获得者）用实验证明了蛋白质的一级结构决定其高级结构。蛋白质的一级结构决定三级结构蛋白质的四级结构蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质与核酸的相互作用，比较简单的体系有血红蛋白、限制性内切酶等，复杂体系有核糖体、病毒、肌肉蛋白等。作用力 破坏因子氢键：-螺旋，-折叠 尿素，盐酸胍疏水作用：形成球蛋白的核心 去垢剂，有机溶剂Van der Waals力：稳

5、定紧密堆积的集团和原子离子键：稳定-螺旋，三、四级结构 酸、碱二硫键：稳定三、四级结构 还原剂配位键：与金属离子的结合 螯合剂 EDTA维持蛋白质空间构象的作用力蛋白质高级结构的原则-自由能最低疏水残基主要被包埋在蛋白质的内部，远离水的作用。极性或带电残基主要存在于蛋白质的表面。蛋白质分子中的氢键数量被最大化。不溶性蛋白质或膜中的蛋白质由于它们的作用或环境遵循不同的规则，但弱的作用力对它们的结构仍然是关键的作用,如：穿膜区呈螺旋结构，侧链外露。多聚体化是球状蛋白质的普遍现象.蛋白质结构与功能蛋白质二级结构与功能的关系球状蛋白质：肽链为卷曲的螺旋肽链，链的折叠很紧密，蛋白质分子内部无空穴。肌红蛋

6、白、血红蛋白和细胞色素c等都是研究得比较清楚的球状蛋白质。纤维状蛋白质：如丝心蛋白等的肽链则为一折叠的伸直肽链。由于肽链折叠或构象的差异，所以形成这两类蛋白质的性质和功能的差异。角蛋白keratin的结构特征 Myosin胶原蛋白Collagen的特殊性Collagen分子聚合体大约 300 nm 长，1.5 nm 粗细, 由三条多肽链（每条多肽链叫alpha chain ） 互相常绕形成。每条alpha chain是 一条左手螺旋，三条多肽缠绕成 a right-handed coiled coil超螺旋。 The sequence often follows the pattern Gly

7、-Pro-Y or Gly-X-Hyp. 肌红蛋白(Myoglobin)N 端 C端肌红蛋白(Myoglobin) 肌红蛋白是一个只有三级结构的蛋白质，有8段 螺旋结构，分别成为A B C D E F G H肽段。整条多肽链折叠成紧密球状分子，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面，因此水溶性较好。Mb分子内部有个袋形空穴，血红素居于其中。His E7 and F8 are the only polar groups inside 肌红蛋白(myoglobin,Mb)与血红蛋白(hemoglobin, Hb)都是含有血红素(Heme)辅基的蛋白质。血红素(Heme)是

8、铁卟啉化合物，由4个甲炔基相连成为一个环形，Fe2+居于环中。铁离子有6个配位键，其中4个与吡咯环的N配位结合，1个配位键和肌红蛋白的93位(F8)组氨酸残基结合，氧则与Fe2+ 形成第6个配位键，接近第64位(E7)组氨酸。Porphyrin Ring: Heme GroupHis F8 (His93)Heme中Fe与O2配位结合自由的血红素中的二价铁被氧化成为三价铁，不再结合氧气。肌红蛋白中的组氨酸能够协助维持血红素中铁为二价形式，保证与氧气的结合能力。肌红蛋白能够维持血红素中铁为二价Isolated heme binds CO 25,000 times as strong as O2.

9、Myoglobin and hemoglobin bind CO 200 times stronger than O2. Lower affinity for CO is due to steric hindrance空间位阻 of distal histidine. Effect of carbon monoxide64位（E7 ）His的咪唑N （远侧）与Fe原子距离远不发生相互作用，但与O2分子能紧密接触，被结合的O2夹在远侧组氨酸咪唑N和Fe（II）之间与氧的结合是一个空间位阻区域。Reversible protein-ligand interactionP + L PLAssocia

10、tion constant: Ka = PL/PLDissociation constant: Kd = 1/Ka蛋白上配体结合的比率： = PL/(PL+P) = L/(L+Kd)当 =0.5时，L=KdMyoglobin上氧气的结合比率： =pO2/(pO2+P50),P50:O20.5 时的氧分压肌红蛋白的P50=0.13KPa(1mmHg) 当在体内毛细血管中氧分压大于30mmHg，组织中Mb几乎全与O2结合而达到饱和肌红蛋白是很好的储氧物质。血红蛋白(Hemoglobin) 血红蛋白具有四个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一个疏水局部，可携带一个血红素并携带一分子氧，因此1分子Hb

11、共结合四分子氧。Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。Hb亚基之间通过八对盐键，使四个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。上图为Hb和Mb的氧解离曲线，前者为S状，后者为直角双曲线。根据S曲线特征可知，Hb中第一个亚基与O2结合以后，促进第二及第三个亚基与氧气的结合，当前三个亚基与O2结合后，又大大促进第四个亚基与O2的结合。血红蛋白的构象变化与结合氧 协同效应(cooperativity) 定义：一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其

12、配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity) 未结合O2时，Hb的1/1和2/2呈对角排列，结构较为紧密，称为紧张态（T态），T态Hb与O2的亲和力小。随着O2的结合，4个亚基羧基末端之间的离子键断裂，其二级、三级、四级结构也发生变化，使1/1和2/2的长轴形成15度的夹角，结构显得相对松弛，称为松弛态（R态）Hb (T态)HbO2 (R态)112215 T (tense) form R (relaxed

13、) form (deoxyhemoglobin) (oxyhemoglobin) Oxygen binding causes T to R transition of Hb T态转变成R态是逐渐结合氧气完成的，在脱氧Hb中，Fe2+半径比卟啉环中间的孔大，因此高出卟啉环平面0.075nm,而靠近F8位组氨酸残基。当第一个O2与血红素结合后，使Fe2+的半径变小，进入到卟啉环中间的小孔中，引起F肽段等一系列微小的移动，同时影响附近肽段的构象，造成两个亚基间离子键断裂，使亚基间结合松弛，可促进第二个亚基与O2结合，依此方式可影响第三、四个亚基与O2结合最后四个亚基全处于R态。The 12 (21)

14、 contact region is designed to act as a switch between two alternative structures. 定义：变构效应亦称别构效应，是指一个蛋白质与它的配体结合后，蛋白质的构象发生变化,使它更适合于功能的需要，这一类变化称为别构效应。 别构蛋白（allosteric protein）：是指具有别构效应的蛋白质或酶.如血红蛋白 别构剂： 亦称效应剂,是指凡能触发蛋白质分子发生别构效应的物质。如O2 变构效应（allosterism effect）Hemoglobin Transports Oxygen Efficiently by B

15、inding Oxygen Cooperatively HbO2Hb + nO2=(pO2)n(pO2)n + P50lg1-= n lg pO2 lg P50The Hill equationThe hill coefficient n is a measure of the degree of cooperativity.Hill Coefficient（Hill 系数）There is cooperation between the multiple binding sites. The degree of cooperation is quantified by this coeffi

16、cient. It is a measure of that degree to which one bound site promotes the binding of further sites. For Hb the hill coefficient can have a value from 1 to 4. For Hb, it is usually 3. For Myoglobin, the Hill Coefficient value is 1, indicating no cooperation.当nH=1，配体结合没有协同性；当nH1，配体结合正协同；当nHpI，带负电荷；pH

17、pI带正电荷。体内多数蛋白pI为5.0左右，在人体体液为pH 7.45环境下，多数蛋白带负电荷。利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。 二、蛋白质的胶体性质颗粒大小：在1100nm之间。胶体，因此溶于水，成为亲水胶体。 稳定亲水胶体的因素： 水化膜 表面电荷由于胶体溶液中的Pr不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。疏水区域蛋白质分子上的电荷与疏水区+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉蛋白质在等电点的溶解度最小

18、pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用三、蛋白质的变性、沉淀和凝固 变性（denatruation）概念: 在某些理化因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。变性因素物理因素：加热、加压、超声波、紫外线化学因素：胍、脲、有机溶剂、强酸强碱、-巯基乙醇、重金属离子、生物碱试剂蛋白质变性后理化性质和物理性质的改变溶解度降低粘度增加结晶能力消失生物活性丧失易被蛋白酶水解应用举例：临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。复性（

19、renaturation）若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性8M尿素或-巯基乙醇透析蛋白质沉淀(protein precipitation)在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。这一现象被称为蛋白质沉淀。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。这种现象称为蛋白质的凝固作用。 由于蛋白质分子中含有酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋

20、白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 蛋白质浓度mg/ml1.45A280-0.74A260四、蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应， 生成蓝紫色化合物。双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。3.BCA(bicinchoninic acid)法（五）蛋白质的呈色反应（续）3.BCA(bicinchoninic acid)法 反应试剂颜色 反应基团

21、有此反应的AAMillon反应硝酸，亚硝酸红色酚基Tyr黄色反应HNO3及NH3 黄、橘黄 苯基 Phe,Tyr乙醛酸反应乙醛酸，H2SO4 紫红吲哚Trp坂口反应次氯酸钠,萘酚 红色胍基 ArgFolin酚试剂反应CuSO4，磷钨酸-钼酸兰色酚基Tyr其它呈色反应蛋白质的分离纯化蛋白质分离纯化的基本原则选择好的材料摸清目的蛋白质的稳定性探索有效的抽提法和浓缩法建立一套层析的组合以较好的方法贮存 初提精纯化盐析 离子交换层析有机溶剂沉淀 分子筛层析等电点沉淀 疏水/反相层析 亲和层析蛋白质分离纯化的具体方法目标：增加制品的纯度或比活，以增加单位蛋白质重量中所需要的蛋白质重量和生物活性。蛋白质的

22、盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度盐 析盐溶Most proteins are less soluble at high salt concentrations, an effect called salting out.For example, 0.8 M ammonium sulfate precipitates fibrinogen, a blood-clotting protein, whereas a concentration of 2.4 M is needed to precipitate serum albumin. Salting out is also usef

23、ul for concentrating dilute solutions of proteins, including active fractions obtained from other purification steps. Dialysis can be used to remove the salt if necessary. 蛋白质的盐析(Salting Out)透析（Dialysis）Semi-permeable membrane, such as a cellulose membrane with pores.Molecules having dimensions sign

24、ificantly greater than the pore diameter are retained inside the dialysis bag, whereas smaller molecules and ions traverse the pores of such a membrane and emerge in the dialysate outside the bag.层析-chromatographyMarch 21, 1903, Meeting of the Warsaw Society of Natural Scientists, Mikhail Semenovich

25、 Tsvet presented a lecture entitled On a New Category of Adsorption Phenomena and its Application in Biochemical Analysis. 1952年获Nobel化学奖Martin & SyngeChromatography began to take its modern form following the work of Archer John Porter Martin and Richard Laurence Millington Synge in the 1940s and 1

26、950s. They laid out the principles and basic techniques of chromatography, and their work spurred the rapid development of several lines of chromatography methods: paper chromatography, gas chromatography, and what would become known as high performance liquid chromatography. Since then, the technol

27、ogy has advanced rapidly. 分离效果差异与理论塔板数N相关 塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。 检测器应答好柱子差柱子理论塔板数与粒子半径成反比因此层析载体的粒径越小，分离效果越好。这就是为什么要发展高压液相色谱（HPLC）蛋白质分离纯化中常用的层析分子筛层析利用分子量差异离子交换层析利用电荷差异疏水/反相层析利用亲疏性差异亲和层析利用特异性

28、亲和物理吸附层析利用非特异性吸附分子筛层析：Molecular sieve chromatography;凝胶过滤层析:Gel filtration chromatography; 或 Gel retardation chromatography. 分子筛层析的工作原理离子交换层析原理离子交换层析的洗脱过程示意离子交换层析原理Types of ion-exchange chromatography media亲和层析Affinity chromatographySmall molecules are attached to beads and complex protein mixtures

29、are applied. Bound proteins can be eluted with the small molecule or with denaturing reagents (urea, guanidine, etc.)Purification glycosylated protein with Lectins（凝集素）, such as concanavalin A 0.5-5 cm 5-100 cm实验室用层析柱 & 工业用层析柱High pressure limits diffusion and increases interactions with chromatogra

30、phy mediaHPLC gives very high resolution of protein components高效液相色谱/HPLC- High Pressure Liquid ChromatographyHPLC基本结构图HPLC层析系统HPLC层析系统填充物的多孔化可以减少层析压灌注层析示意Can be used to compare different methodologies for purification of the same proteinCan be used to standardize the purification of proteins in dif

31、ferent laboratoriesProtein Purification SchemesTotal protein. The quantity of protein present in a fraction is obtained by determining the protein concentration of a part of each fraction and multiplying by the fractions total volume. Total activity. The enzyme activity for the fraction is obtained

32、by measuring the enzyme activity in the volume of fraction used in the assay and multiplying by the fractions total volume. Specific activity. This parameter is obtained by dividing total activity by total protein. Yield. This parameter is a measure of the activity retained after each purification s

33、tep as a percentage of the activity in the crude extract. The amount of activity in the initial extract is taken to be 100%. Purification level. This parameter is a measure of the increase in purity and is obtained by dividing the specific activity, calculated after each purification step, by the sp

34、ecific activity of the initial extract. 蛋白质分子量的确定方法超离心法: M=RTs/(1-)D 凝胶过滤: v=k + clogMSDSPAGE法: d=k + clogM光散射法: M=/Hc渗透压法: M=cRT/Centrifugationseparating and analyzing bio-molecules determining mass and density of a molecule, learning information about the shape of a moleculeinvestigating the inter

35、actions between molecules.Sedimentation coefficients are usually expressed in Svedberg units (S), equal to 10-13 s. The smaller the S value, the slower a molecule moves in a centrifugal field. Massthe reciprocal of the particle density the frictional coefficient (a measure of the shape of the partic

36、le) Differential centrifugation - a first step in protein purificationZonal Density Gradient CentrifugationMolecules are separated by the rate at which they sediment in a density gradientThe sedimentation coefficient is a means of quantifying density sedimentation ratesMass Spectrometry (质谱法) can ac

37、curately determine the mass of proteinsmatrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) the time of flight (TOF) in the electrical field is a measure of the mass (or, more precisely, the mass/charge ratio). MALDI MS 基质辅助激光解析/电离质谱ESI MS 电喷雾电离质谱The Time of Flight of the protein ions is related to t

38、he mass to charge ratio of the protein ionMS/MS质谱联用蛋白质的电泳 最早的电泳装置1930年Tiselius的装置Tiselius,1948年因电泳分离血清蛋白的工作获得诺贝尔化学奖 垂直板电泳装置水平式电泳装置电泳槽几种常用的蛋白电泳方法SDS（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）等电聚焦电泳双向电泳SDS凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)A molecule with a net charge will move in an electric field. This phenomenon, te

39、rmed electrophoresis.Molecules are separated by size in an electric field. Smaller molecules migrate more rapidly through porous gel matrix起源1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。Polyacrylamide is a useful polymer for gel electrophor

40、esis because both the concentration and cross-linking of the gel can be controlled.Pore size is directly controlled by acrylamide concentrantion.Acrylamide Polymerization基本原理之一阴离子去污剂SDS 破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。强还原剂巯基乙醇 打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。基本原理之二结合了SDS的

41、蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。分类 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类. 连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统 不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还

42、具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。浓缩胶 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。分离胶 孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使样品很好的分离.当样品进入分离胶,pH,凝胶孔径改变,使慢离子的泳动率变大,超过蛋白,高强度电场消失.因此蛋白在均一的pH,和电场强度下通过分离胶.如果蛋白质分子量不同,通过分离胶受到的摩擦力不同，泳动率也不同,因此能够根据蛋白的分子量不同而分开。 凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这

43、样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。浓缩效应之一浓缩效应之二 电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界

44、面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。电荷效应之一电荷效应之二 与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得SDS电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。电

45、荷效应之三 但在SDS电泳中，由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位，这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近

46、 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3%的蛋白质。分离范围凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用515%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）1512431016687.536945.057212双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1：29。实验中各成分作用聚丙烯酰胺激活剂SDS甘氨酸上样缓冲液固定液染色剂 被激活的单体和未被激活的单体反应开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地通过bis的作用进行交叉互联成为网状结

47、构，最终多聚物聚合成凝胶状，而其孔径大小等特征由聚合条件及单体浓度决定。聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠(SDS)SDS是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，再与PAGE技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量。SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量的差异将各种蛋白质分开。 样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界,而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样

48、品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。甘氨酸上样缓冲液之一 蛋白上样缓冲液(SDSloadingbuffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS蛋白电泳样品上样。 蛋白上样缓冲液分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和

49、使用时请务必注明，仔细区分。上样缓冲液之二注意事项 分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中含一定量的DTT或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较易区分； 含巯基的试剂有一定的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。 指示剂检测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。 上样缓冲液之三固定液（甲醇/冰醋酸）Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸=3:l）甲醇：有固定、

50、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。甲醇固定的特点是失活快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20左右)，可使材料变硬。冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.30.5的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。 染色剂 考马斯亮蓝染色 0.1 g常用染色方法 银染法 0.02 g 金属离子染色法以考马斯亮蓝染色为例 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 考马斯亮蓝最大光吸收在488nm；当它

51、与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。结果处理 测量并计算分子量蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式 Mw K(10bm) (1) lgMw = lgKbm = K1bm (

52、2) 其中MW是蛋白质分子量；K和K1为常数 b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。mR=dpr/dBPB 标准蛋白分子量在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。实验注意事项1. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有：线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。2. 注意不能随便倾倒单体溶液（是一种神经毒剂），应加入过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。3. TEMED，四甲基乙二胺中混有氧化试剂后其自身

53、极易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化产物呈黄色，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶速度。4. APS，过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性剂凝胶)。实验注意事项（续）5. 激活剂的用量： 激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。增加过硫酸铵或TEMED的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失

54、去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。实验注意事项（续） 6. 温度的影响： 聚胶的最佳温度为2325 ，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。实验注意事项（续） 7. 氧气的影响： 氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂

55、得到最佳聚合效果。通常在较好的真空度(125torr) 脱气至少15 min 。实验注意事项（续）8. 凝胶添加剂： 凝胶中常常加入SDS、尿素、Triton X-100等添加剂。SDS加入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。实验注意事项（续） 9. 聚胶时间： 虽然应用过硫酸铵TEMED催化后灌胶1520 min即可观察到凝胶的形成，但至少需90 min才能保证95以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。10. 单体的浓度：是指单体总重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可选择的范围为330，单体浓度增加后聚合速度将加快，

56、因此可适当减少催化剂的用量。实验注意事项（续） 11. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。12. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS测定分子量有10误差，不可完全信任。实验注意事项（续）13. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。 14. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋

57、白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。实验注意事项（续）常见问题及处理办法纹理和拖尾现象： 由于样品溶解不佳或SDS不纯引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。蛋白带过宽：与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。电泳时间比正常要长： 可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率。.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。常见问题及处理办法（续）6. 凝胶时间不对：通常胶在30min内凝聚如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS剂不够或者失效。7. 出现“皱眉”（两边向下中间鼓起）： 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。常见问题及处理办法（续）8. “鬼带”： “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚