生物化学A（上）-6酶

1、蛋白质-酶2014年3月24日1蛋白质结构与功能2肌红蛋白(Myoglobin) 肌红蛋白是一个只有三级结构的蛋白质，有8段 螺旋结构，分别成为A B C D E F G H肽段。整条多肽链折叠成紧密球状分子，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部，富极性及电荷的则在分子表面，因此水溶性较好。Mb分子内部有个袋形空穴，血红素居于其中。His E7 and F8 are the only polar groups inside3His F8 (His93)Heme中Fe与O2配位结合4蛋白-配体的可逆相互作用P + L PLAssociation constant: Ka = PL/PLDisso

2、ciation constant: Kd = 1/Ka蛋白上配体结合的比率： = PL/(PL+P) = L/(L+Kd)当 =0.5时，L=KdMyoglobin上氧气的结合比率： =pO2/(pO2+P50),P50:O20.5 时的氧分压肌红蛋白的P50=0.13KPa(1mmHg) 当在体内毛细血管中氧分压大于30mmHg，组织中Mb几乎全与O2结合而达到饱和肌红蛋白是很好的储氧物质。5血红蛋白(Hemoglobin) 血红蛋白具有四个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一个疏水局部，可携带一个血红素并携带一分子氧，因此1分子Hb共结合四分子氧。Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。Hb亚

3、基之间通过八对盐键，使四个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。6肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线7 协同效应(cooperativity) 定义：一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity)8 定义：别构效应亦称变构效应，是指一个蛋白质与它的配体结合后，蛋白质的构象发生变化,使它更适合于功能的需要，这一类变化称为别构效应。 别构蛋白（allosteric prot

4、ein）：是指具有别构效应的蛋白质或酶.如血红蛋白 别构剂： 亦称效应剂,是指凡能触发蛋白质分子发生别构效应的物质。如O2 变构效应（allosterism effect）9 T态转变成R态是逐渐结合氧气完成的，在脱氧Hb中，Fe2+半径比卟啉环中间的孔大，因此高出卟啉环平面0.075nm,而靠近F8位组氨酸残基。当第一个O2与血红素结合后，使Fe2+的半径变小，进入到卟啉环中间的小孔中，引起F肽段等一系列微小的移动，同时影响附近肽段的构象，造成两个亚基间盐键断裂，使亚基间结合松弛，可促进第二个亚基与O2结合，依此方式可影响第三、四个亚基与O2结合最后四个亚基全处于R态。10HbO2Hb +

5、nO2=(pO2)n(pO2)n + P50lg1-= n lg pO2 lg P50The Hill equationThe hill coefficient n is a measure of the degree of cooperativity.11当nH=1，配体结合没有协同性；当nH1，配体结合正协同；当nHpI，带负电荷；pH k2时，此时酶和底物的分离远比产生酶和产物的速度快得多；KM KES = k-1/k1=ES/ES即当k-1 k2时，KM 等于ES复合物的解离常数;在这个条件下：KM高，结合弱；KM低，结合强。 KM是酶的特征性常数之一=Kmk1k2k-1+121米氏常

6、数KM的意义（续）Km值越小, 底物与酶的亲和力越强, 反应越迅速122123定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=k2 E0如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnover number)，即动力学常数k2。Vmax的意义124kcat 和 specificity constantkcat :当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。也叫 turnover number转换数kcat /Km :专一性常数, 用来比较不同酶作用于同一底物, 或同一种作用于不同底物的催化效率;数值接近109为佳。125酶的转换数

7、Turnover number (kcat)意义：可用来比较每单位酶的催化能力。The Kcat is a direct measure of the conversion of substrate to product under optimum conditions, i.e. saturated enzyme.The number of substrate molecules turned over per enzyme molecule per second, hence “turnover number”.The overall rate of a reaction is limit

8、ed by its slowest step. Hence, the Kcat will be equal to the rate constant for the slowest step.In the case of the Michaelis-Menten system this will be k2 E + S ESE + Pk1k-1k2126127specificity constant: kcat/KMThe ratio kcat/KM is a convenient measure of enzyme efficiencyA good enzyme has a high kca

9、t/KM ratioThis could result from:Large kcatSmall KM128同一个酶对不同的底物可以有不同的米氏常数胰凝乳蛋白酶129同一个酶对不同的底物可以有不同的米氏常数胰凝乳蛋白酶130米氏方程作图131Taking the reciprocal of both sides can giveThis is in the general form y = m x + ci.e. a plot of 1/v against 1/S will give straight lineThis is a Lineweaver-Burk plot132Lineweave

10、r-Burk plot(双倒数作图) 1/v = Km/Vmax *1/S + 1/Vmax 1/V1/S-1/KM1/VmaxKM/Vmaxslope =Lineweaver-Burk plot133Eadie-Hofstee plotHanes plot请从米氏方程推导134Cornish-Bowden plotDixon plot135双底物的米氏方程136三聚物模式(ternary complex)乒乓式(ping-pong)两种不同模式的双底物反应137双底物反应的米氏方程当P1, P2 = 0 时太复杂了！ Forget it!138二、酶浓度对反应速度的影响当SE，反应速度与酶浓

11、度成正比。关系式为：V = K2 E0 V E 139双重影响最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。低温的应用三、温度对反应速度的影响酶活性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度 C 140四、 pH对反应速度的影响 最适pH(optimum pH)：酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性 pH胃蛋白酶 淀粉酶 胆碱酯酶 246810141五、抑制剂对反应速度的影响酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。区别于酶的变性抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因素对酶没有选择

12、性142抑制作用的类型不可逆性抑制 (irreversible inhibition)可逆性抑制 (reversible inhibition)：竞争性抑制 (competitive inhibition)非竞争性抑制 (non-competitive inhibition)反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition)143不可逆性抑制作用* 概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活，不能用透析、超滤等方法予以除去。 * 举例有机磷化合物 羟基酶解毒 - - - 解磷定(PAM)重金属离子及砷化合物 巯基酶解毒 - - - 二巯基丙醇(BAL) 144

13、有机磷化合物对羟基酶的抑制+E-OHROPOXROROPOO-ERO+ HXE-OHORPOORNCH3CHNOH+NCH3CHNO+有机磷化合物磷酰化酶羟基酶酸解磷定145重金属离子及砷化合物毒性路易士气失活的酶巯基酶失活的酶酸BAL二巯基丙醇巯基酶BAL与砷剂结合物146可逆性抑制作用概念：抑制剂以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。类型：竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制 1471. 竞争性抑制作用抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。148竞争性抑制149I与S结构类似，竞

14、争酶的活性中心；抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及S；动力学特点：Vmax不变，表观Km。竞争性抑制的特点抑制剂 无抑制剂 1/v 1/S 150琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸举例1：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制151举例2：磺胺药对细菌二氢叶酸合成酶的抑制Glu +H2NCOOH +FH2FH4H2NSO2NHRPABAFH2合成酶二氢蝶呤氨甲蝶呤磺胺药FH2还原酶1522. 非竞争性抑制抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系。153非竞争性抑制154非竞争性抑制的特点抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合；抑制程度取决于I；动力学特点：Vmax，表观Km不

15、变。抑制剂 1/v 1/S 无抑制剂 1553. 反竞争性抑制抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使ES的量下降。156反竞争性抑制157抑制剂只与ES结合；抑制程度取决与I及S；动力学特点：Vmax，表观Km。反竞争性抑制的特点抑制剂 1/V 1/S 无抑制剂 158各种可逆性抑制作用的比较 作用特征竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制与I结合的组分EE、ESES表观Km增大不变减小Vmax不变降低降低159不同类型抑制作用的米氏方程160I竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制161六、激活剂对反应速度的影响激活剂(activator)使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。 必需激活剂

16、(essential activator) 非必需激活剂 (non-essential activator)162七、酶活性测定和酶活性单位酶的活性单位：在规定条件下，酶促反应在单位时间（s、min或h）内生成一定量（mg、g、mol等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。163酶活性单位国际单位(IU)在特定的条件下，每分钟催化1 mol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位催量单位(katal)催量(kat)是指在特定条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所需的酶量kat与IU的换算： 1 IU=16.6710-9 kat164酶的分离纯化165Can be used to compare

17、 different methodologies for purification of the same proteinCan be used to standardize the purification of proteins in different laboratoriesProtein Purification Schemes166比活（specific activity）：酶单位数/mg 蛋白质酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性167Total protein. The quantity of protein present in a fraction is obtaine

18、d by determining the protein concentration of a part of each fraction and multiplying by the fractions total volume. Total activity. The enzyme activity for the fraction is obtained by measuring the enzyme activity in the volume of fraction used in the assay and multiplying by the fractions total volume. Specific activity. This parameter is obtained by dividing total activity by total protein. Yield. This parameter is a measure of the activity retained after each purification step as a percentage of the activity in the crud