实验操作指导书：离子交换柱层析纯化蔗糖酶

1、 （二）离子交换柱层析纯化蔗糖酶一、试剂 1. DEAE纤维素：DE-23 1.5克 2. 0.5N NaOH 100ml 3. 0.5 N HCL 50ml 4. 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液250ml 5. 0.02 mol/L pH7.3（含0.2 mol/L浓度NaCl）的Tris-HCl缓冲液 50ml二、仪器 1. 层析柱 2. 部分收集器 3. 磁力搅拌器及搅拌子 4. 50ml小烧杯2个 5. 玻璃砂漏斗 6. 真空泵与抽滤瓶 7. 精密pH试纸或pH计 8. 三通管 9. 止水夹 10. 吸耳球 11. 塑料紫外比色杯 12. 电导率仪 13.

2、 尿糖试纸 14. 点滴板三、操作步骤离子交换剂的处理： 称取1.5克DEAE纤维素（DE-23）干粉，加入0.5mol/L NaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡至少0.5小时（不超过1小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，再用0.5 mol/L NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。（因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收）。实际操作时，通常纤维素是已浸泡过回收的，按“碱酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除

3、去细颗粒，抽干后用0.5 mol/L NaOH0.5 mol/L NaCl 溶液处理，然后水洗至中性。装柱与平衡： 先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用20ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液和20ml含0.2M浓度NaCl的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50ml小烧杯，一个装20ml含NaCl的高离子

4、强度溶液，另一个装入20ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子（在细塑料管内放入一小段铁丝，两端用酒精灯加热封口），将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸耳球小心地将溶液吸入三通（轻轻松一下止水夹），立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通，注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。 用5ml 0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分，（注意玻璃搅棒头必须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤），若溶液混浊，则用小试管，4000rpm离心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇级分样

5、品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将剩余的3.5ml清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管2.53.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中，用胶布固定塑料管，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速2.53.0ml/10min。 测定每管洗脱液的A2

6、80光吸收值和电导率。（使用DJS-10电导电极） 测定不含NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液和含0.2mol/L浓度NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液的电导率，用电导率与NaCl浓度作图，利用此图将每管所测电导率换算成NaCl浓度，并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度。 4. 各管洗脱液酶活力的定性测定 在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol/L pH4.9的乙酸缓冲液，一滴0.5mol/L蔗糖和一滴洗脱液，反应5分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，1020min后观察试纸颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性最高的23管，量出总体积，并将其分成10份，分别倒入10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存，使用时取出一管。此即“柱级分IV”。 注意：从上样开始收集