复方二精灵多糖抗脑缺血缺氧损伤的分子机理

1、复方二精灵多糖抗脑缺血缺氧损伤的分子机理【关键词】复方二精灵摘要：目的：研究复方二精灵多糖抗脑缺血损伤的分子机理。方法：采用全细胞膜片钳技术记录急性别离的小鼠海马A1区神经元电压门控性钠电流，观察复方二精灵多糖对钠电流的影响，拟从离子通道程度提醒复方二精灵的抗缺血缺氧脑损伤作用。结果：0.1%复方二精灵多糖显著抑制海马神经元电压门控性钠通道电流锋值，使钠电流的半激活电压向去极化方向偏移，不影响钠电流的稳态失活及复活曲线。结论：复方二精灵多糖对海马神经元电压门控性钠电流的抑制作用可能为复方二精灵抗缺血缺氧脑损伤的重要机理。关键词：复方二精灵；海马神经元；电压门控性钠通道Theleularehan

2、isfpundErjinglingPlysaharideNeurprtetinEffetnHypxiaandIsheiaDaageAbstrat:Usinghleellpathlaptehnlgyntheebraneffreshlyislatedhippapalneurns,theeffetsfpundErjinglingplysaharidenvltagegatedsdiuurrentserebservedtinvestigateitsleularehanisfneurprtetininhypxiaandisheiadaage.Theexperientaldatadenstratedthat

3、peaksdiuurrentsfhippapalneurnsdereasedsignifiantlyafterappliatinf0.1%pundErjinglingplysaharide(fr100%t60.9612.13%,n=16，P0.05).Thehalf-axiuativatinvltagefINashiftedfr29.984.30Vt15.852.9Vafteradinistering0.1%pundErjingling(n=6,P0.05).TheinhibitineffetsfpundErjinglingplysaharidensdiuurrentsinhippapalne

4、urnsuldpartlyexplaintheneurprtetinfpundErjinglinginhypxiaandisheiadaage.Keyrds:pundErjinglingplysaharide；vltagegatedsdiuhannel；Hippapalneurn复方二精灵是由枸杞子FrutusLyii和黄精RhizefKingSlseal组成，最早收载于?圣济总录?，具有“助气固精，补填丹田，活血驻颜，长生不老之成效。现代研究证实复方二精灵可拮抗谷氨酸对离体培养神经细胞的兴奋性毒作用，明显降低缺血缺氧小鼠脑组织乳酸含量，使海马细胞变性及肿胀程度减轻，从而改善拟痴呆小鼠的学习记

5、忆才能1。复方二精灵成分复杂，种种迹象说明复方二精灵中的黄精多糖2和枸杞多糖3是其抗缺血缺氧脑损伤的重要活性部位，但因缺乏分子程度的合理解释，制约了复方二精灵的临床使用。由于缺血缺氧过程中神经细胞变性损害与神经细胞膜上电压门控性钠通道介导的钠离子内流增强有关4，多种药物正是通过阻滞神经细胞膜上电压门控性钠通道而发挥脑保护作用5，6。在所有脑神经元中，海马神经元对缺血缺氧最为敏感7，海马组织也是学习记忆功能的关键脑区8，能否有效减轻海马神经元损伤成为缺血缺氧过程中脑保护的关键。鉴于此，本研究主要观察复方二精灵多糖对急性别离的小鼠海马神经元电压门控性钠通道的影响作用，拟从分子程度提醒其在缺血缺氧过

6、程中的脑保护作用。1材料与方法1.1复方二精灵多糖的制备取黄精和枸杞各50g，混匀。依次用5倍体积石油醚-丙酮V/V11回流脱脂，5倍体积80乙醇(V/V)脱单糖、低聚糖等杂质，然后用1000l热水提取3次，水提取液合并，60减压浓缩至1.5倍体积，浓缩液以95乙醇沉淀，至乙醇浓度为80，沉淀2次，沉淀物依次用95乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤脱水，60真空枯燥得粗多糖7.30g。复方二精灵多糖含量用硫酸-苯酚法490n处检测，其含量为80.8。1.2海马神经元的急性别离一月龄昆明种小鼠1520g，武汉大学实验动物中心提供颈椎脱臼处死，断头取脑于4的D-hanks液中冷冻1in后移入氧饱和的ASF液

7、中别离双侧海马。在32的恒温水浴摇床中孵育海马40in后参加0.2/l链酶蛋白酶E(prtease,Siga)消化20in，在解剖显微镜下用细解剖针将海马1区分割下来并移入氧饱和的DE/F12培养液中，用尖端热抛光处理的吸管(口径依次为500，300和150)将之吹打成细胞悬液。将细胞悬液经200目筛网过滤至直径35的培养皿内，待细胞贴壁后更换外液两次，行全细胞膜片钳记录。实验在室温2225范围内进展。1.3记录液及实验用药记录海马神经元电压门控性钠通道电流的细胞外液成分为(l/L)：Nal145.0；Kl5.0；al22.0；gl21.0；HEPES10.0；DGluse10.0；4AP1.

8、0；l-TEA20.0，pH7.4。记录钠通道电流的细胞内液成分为l/L：sl100.0；KF40.0；al21.0；gl22.0；EGTA10.0；HEPES10.0；Na2ATP5.0；lTEA20.0，pH7.2。以上所用药物中4AP，EGTA，HEPES，lTEA及Na2ATP为Siga公司产品，其它为国产分析纯。实验过程中所用药物复方二精灵多糖用细胞外液配制成0.1%的浓度。1.4全细胞膜片钳记录应用EP9双通道膜片钳放大器HEKA公司，Gerany行全细胞膜片钳记录。仅选用形态为锥形或梭形、有顶树突和基树突特征的锥体细胞进展全细胞膜片钳记录观察钠通道电流。在电极与细胞膜之间形成高阻

9、(15G)封接后，负压破膜，并给予适当的电容补偿，在设定的刺激电压下，观察钠电流的激活情况。先观察正常钠电流，再经DAD给药系统ALA，USA向细胞喷射0.1%的复方二精灵多糖，记录给药后的钠通道电流。1.5实验资料的处理实验资料经plusefit软件及IGR软件进展分析处理，实验数据用s表示。对各组数据分别进展t检验，以P0.05作为显著性检验的标准。2结果2.1复方二精灵多糖对海马神经元电压门控性钠通道锋电流的影响在90V的钳制电位下，从60V起给予10V步幅递增、80s步宽的去极化脉冲刺激至+60V，分别激活并记录给药前后海马神经元钠通道电流。本研究以单纯的外液冲洗对海马神经元电压门控性

10、钠电流的影响为对照，考察0.1%复方二精灵多糖给药前后海马细胞钠通道电流峰值的改变情况。详细做法是设置外液冲洗给药前钠电流峰值为100%，按照公式冲洗给药后Iax/冲洗给药前Iax100%对外液冲洗给药后所记录的海马细胞钠电流峰值进展标准化。结果发现单纯外液冲洗即刻使海马细胞钠电流峰值略微增加至冲洗前的(111.6214.35)%，而0.1%复方二精灵多糖给药即刻使海马细胞钠电流峰值明显减少至给药前的(60.9612.13)%。与单纯的外液冲洗相比，0.1%复方二精灵多糖给药即刻显著抑制海马细胞钠电流峰值(n=16，P0.05)。转贴于论文联盟.ll.2.2复方二精灵多糖对海马神经元电压门控性

11、钠通道激活、失活及复活动力学特性的影响将膜电位钳制在90V，从60V起给予10V步幅递增、80s步宽的去极化脉冲刺激至+60V，引出钠通道电流(图2A)。以测试电压为横轴，测试电压所对应的标准化电流值为纵轴，绘制给药前后电流的稳态激活曲线，钠电流的稳态激活曲线用Bltzann方程拟合得出海马神经元钠通道给药前后的半激活电压值(1/2)：I/Iax=1/1+exp(V-V1/2)/k。(表示测试电压所对应的钠电流峰值，1/2表示50最大激活时所对应的测试电压,k为曲线的斜率)。结果说明0.1%的复方二精灵多糖显著改变了海马神经元稳态激活曲线图2a，使半激活电压由给药前的(29.984.30)V去

12、极化偏移至(15.852.9)VP0.05,n=16。将膜电位钳制在90V，采用双脉冲刺激方法观察钠通道的稳态失活情况，即先给予10V步幅递增、30s步宽、90V-20V的条件刺激电压，每一条件刺激后紧跟一30s步宽、20V的测试电压刺激(图2b)。以测试电压所激活的标准化钠电流峰值I/Iax对条件刺激电压作图绘制稳态失活曲线，也用Bltzann方程拟合得出海马神经元钠通道给药前后的半失活电压值(1/2)：I/Iax=1/1+exp(V-V1/2)/k。(表示测试电压所对应的钠电流峰值，1/2表示50最大激活时所对应的测试电压,k为曲线的斜率)。结果发现，0.1%的复方二精灵多糖给药前后海马神

13、经元稳态失活曲线没有明显改变(55.420.75)Vvs(53.520.88)V,P0.05,n=6)图2b。将膜电位钳制在90V，采用双脉冲刺激方法观察钠通道失活后的恢复情况，即在每一条件刺激电压后都施加一测试电压刺激，条件刺激电压和测试电压的宽度均为30s，两次刺激的时间间隔从2s开场，以2s等差递增至36s，条件刺激电压和测试电压均为20VFig2。以测试电压所激活的标准化钠电流峰值I/Iax对时间间隔t作图绘制失活后的恢复曲线，并用单指数函数拟合曲线，得出钠通道给药前后失活后恢复的时间常数：I(t)/Iax=A0+A1et。t为条件刺激电压和测试电压之间的时间间隔，I(t)表示测试电压

14、所对应的钠电流峰值，为失活后恢复的时间常数。结果发现，0.1%的复方二精灵多糖给药前后海马神经元稳态复活曲线没有明显改变(图2)，给药前半复活时间常数为(6.210.27)s，给药后为(7.380.42)sP0.05,n=6。3讨论海马组织是哺乳动物学习记忆形成的关键脑区，也是缺血缺氧易损区域，海马组织的损害会引起学习和记忆功能受损7，8。目前认为细胞内钙离子浓度的增加是急性脑缺血缺氧引起海马细胞死亡的重要原因9，因为细胞质内a2+浓度的增高,可继发线粒体内钙积聚，继而可出现线粒体膜通透性增加，大量氧自由基产生并释放，最终线粒体损坏致细胞能量供给障碍，引起细胞死亡10。导致缺血缺氧时神经细胞内

15、钙浓度增加的原因很多，而其中神经细胞膜电压依赖性钠通道介导的钠内流增强与细胞内钙超载关系尤为亲密，钠内流增强引起细胞内钠离子浓度升高，细胞膜及线粒体膜上Na+/a2+交换相应增强，导致细胞质中游离a2+的增加4。正因为神经细胞膜上电压门控性钠通道在缺血缺氧时细胞内钙超载发生中的重要地位，大量的研究工作也试图去证实钠通道阻滞药在脑缺血缺氧过程中的神经保护作用。实际上多种药物也正是通过阻滞神经细胞膜上电压门控性钠通道而发挥缺血缺氧过程中的脑保护作用的510。所以阻断+通道是近年抗脑缺血缺氧损伤药物研发中的一个研究热点。黄精和枸杞为祖传名贵益智中药。现代药理学实验也证实了黄精11、枸杞12具有良好的

16、抗衰老、改善痴呆病症的作用。黄精、枸杞的益智作用与其在缺血缺氧过程中的脑保护作用有关13，14，其中黄精多糖和枸杞多糖是它们抗缺血缺氧损伤的重要活性部位2，3。复方二精灵为等量黄精、枸杞配伍提取而成，最近的研究报道指出复方二精灵对体内外缺血缺氧损伤模型中的神经细胞均有明显的保护与改善作用，这可能是复方二精灵改善学习记忆的重要原因1。然而复方二精灵在脑缺血缺氧过程中的神经保护作用尚缺乏分子程度的合理解释，制约了该药的临床应用。考虑到在复方二精灵的多种组分中，黄精多糖和枸杞多糖是其抗缺血缺氧脑损伤的重要活性部位，本研究利用现代膜片钳实验技术，在急性别离的小鼠海马细胞膜上观察了复方二精灵多糖对电压门

17、控性钠通道的影响。结果发现复方二精灵多糖可显著抑制急性别离的海马神经元电压门控性钠通道电流锋值，使钠通道半激活电压向去极化方向偏移。根据本实验研究结果结合其他的研究报道，本课题组认为复方二精灵改善急性脑缺血缺氧所致记忆障碍的机理之一为其多糖组分抑制海马细胞电压门控性钠通道，有效阻止了海马细胞内钙积聚，在一定程度上减弱了海马细胞内钙超载所致海马细胞损伤。由于本研究所使用的药品为复方二精灵的多糖组分，其对海马细胞电压门控性钠通道的抑制作用是多种成分共同作用的结果还是某单一成分的效应尚有待进一步的研究。参考文献：1黄敬耀，周瑾，魏海，等.复方二精灵抗老年性痴呆的药理实验研究J.江西医学院学报，200

18、1，41(2)：5356.2黄芳，陈桃林，蒙义文.黄精多糖对老龄大鼠记忆获得和记忆再现的影响J.应用与环境生物学报，1999，5(1):3939.3钱彦丛，宇文萍.枸杞子的化学成分及药理研究新进展J.中医药学报，20004：3335.4artinezS,StriggF,ShrderUH,etal.Na+anda2+hestasispathays,elldeathandprtetinafterxygen-gluse-deprivatininrgantypihippapalslieulturesJ.Neursiene2022,1284：729740.5HeittKE,StysPK,LesiukHJ

19、.Theuse-dependentsdiuhannelblkerexiletineisneurprtetiveagainstglbalisheiinjuryJ.BrainRes2001，8982：281287.6SangN,engZ.BlkadebyagnesiufsdiuurrentsinautelyislatedhippapalA1neurnsfrat.JBrainRes2002，9522：218221.7IkedaT,ishiaK,AN,etal.binatintreatentfnenatalratsithhypxia-isheiaandendtxinindueslng-lastingeryandlearningipairentthatisassiatedithextendederebraldaageJ.AJbstetGynel2022，1916：21322141.8NEighGN,GlasperER,KflerJ,etal.ardiaarrestithardipulnaryresusitatinreduesdendritispinedensityinA1pyraidalellsandseletivelyaltersaquisitinfspatialeryJ.EurJNeursi2022，20