影响PCR的主要因素

1、影响PCR的主要因素1.模板DNA单链、双链DNA均可作为PCR的模板，DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。模板用量依具体实验而定，一般为100ul反应液有105-106个目标分子。PCR反应时模板变性要充分。2. PCR引物PCR引物设计是否成功是能否获得高质量PCR产物最关键的因素之一。在设计和应用时，需注意以下重要环节：（1）PCR引物的长度约为1830个核苷酸，并且成对引物间的GC含量应相似。以使它们在相近的温度下与其互补序列结合。G+C含量应为45%55%之间。碱基分布是随机的，应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3，端出现3个连续G或C，否则会使引物在

2、G+C富集序列区错误引发。引物3，端碱基最好选用A、G、C,尽可能地避免选用T ,尤其应避免连续出现2个以上T。（2）一般来说，PCR产物500bp时，引物长度选择16-18bp；PCR产物5kb时，引物长度选择24bp左右为宜。（3）要避免引物分子自身序列互补，否则会形成发夹样二级结构。两个PCR引物相互之间的3，末端序列不能有明显的互补性，以免形成引物二聚体。（4）引物的熔点温度（Tm值）要适当。Tm值与引物的碱基组成和长度有关；PCR引物的GC/AT应与要扩增的模板DNA相当或略高些。一般熔点温度以大于55为宜。（5）引物的3，末端必须与模板严格互补，而5，末端的要求可灵活些。（6）目前

3、在引物选择中已广泛应用计算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。（7）用于亚克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性内切酶位点。为了保证内切酶有效酶切扩增产物，一般在酶切位点的5，端再加上几个额外的碱基。（8）引物的浓度，在终浓度为0.21.0 umol/L的范围内产量基本相同，低于0.2 umol/L时会影响产量。但过高时一乃不经济，二则会出现非特异扩增及增加引物二聚体的产生。3. 热稳定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）一般用量为2.5 U/100uL 反应体积。酶量过多易导致非特异性产物的产生。该类

4、酶的最适温度为75，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物-模板的非特异延伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。4. dNTPsPCR常用的dNTP浓度在50-200umol/L。四种dNTPs应等当量。浓度低则反应速度下降，过高则特异性下降，可根据具体实验来确定最适的dNTP浓度。5. PCR缓冲液因PCR反应中的dNTP能与Mg2+结合，影响反应液中游离Mg2+的浓度，所以应按不同条件，确定合适的Mg2+浓度。一般在标准的PCR反应中（dNTP浓度200umol/L），Mg2+浓度约为1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响PCR的产量及产物特异性。

5、浓度高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%0.1%)及5mmol的二硫苏糖醇（DTT）对酶有一定的保护作用。6. PCR循环的温度预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一般为94 3-5min。变性不完全时，DNA双链会很快复性，影响PCR反应，但若变性温度太高（不宜超过95），会影响Taq酶的活性。变性：一般为94 30s或95 20s。引物退火：应根据具体反应中引物与模板的碱基配对情况及实验的目的确定。一般为50-72。退火温度增高会增强对不正确退火引物的识别，还能降低引物3，端不正确核苷酸的错误延伸。延伸：一般为72 60-90s。最后一个循环后应在72保留5min，以保证PCR产物合成的完整性。7 平台效应和PCR循环的次数在PCR基因扩增的后期，由于产物的堆积，将使原来产物以指数增加的速度变为平坦曲线，即所谓平台效应。它的出现是由于PCR原料的不断消耗、酶的稳定性的降低、终产物的阻滞效应及非特异性产物等