08制药环境分离微生物的鉴定技术应用-余萌

1、制药环境分离微生物的鉴定技术应用中检院微生物检测室2019.4.26中国食品药品检定研究院Nation Institutes for Food and Drug Control主要内容制药环境微生物微生物分离鉴定技术鉴定技术应用National Institutes for Food and Drug Control1.制药环境微生物Clean Room: A room in which he concentration of airborne particles is controlled to meet aspecified airborne particulate cleanliness

2、 Class. In addition, the concentration ofmicroorganisms in the nvironment is monitored; each cleanliness Class defined is alsoassigned a icrobial level for air, surface, and personnel gear.(USP1116)CleanroomRABSIsolatorNational Institutes for Food and Drug Control1.制药环境微生物设备空气Controlled e vironmen s

3、：air,surface, personnel gear制药环境人员水系统National Institutes for Food and Drug Control1.制药环境微生物National Institutes for Food and Drug Control1.制药环境微生物 空气： 主动空气采样:采样器 被动空气采样：沉降板 表面： 接触碟 拭子 表面冲洗 人员Drug Control关注环境微生物的意义微生物分布特点、迁移规律0102人员培训、操作清洁消毒程序0304反映生产环境是否处于充分受控的状态DocumentRecommendationEC guide to GMP,

4、 Revision of Annex 1, Manufacture of SterileMedicinal ProductsIf microorganisms are detected in a grade A or B zone, they should be identified tospecies level and the impact of such microorganisms on product quality (for each batchimplicated) and state of control should be evaluated. Consideration m

5、ay also be given tothe identification of grade C and D contaminants and the requirements should be definedin the contamination control strategy.FDA Guidance for Industry- Sterile Drug Products Produced byAseptic Processing-Current Good Manufact ring PracticeMonitoring critical and immediately surrou

6、nding clean areas as well as personnelshould include routine identification of microorganisms to the species (or, whereapp opriate, genus) level.t minimum, the program should require species (or, where appropriate, genus)identification of microorganisms in these ancillary environments at frequent in

7、tervals toestablish a valid, current database of contaminants present in the facility during processing(and to demonstrate that cleaning and sanitization procedures continue to be effective).Pharmaceutical Inspection Co-cooperation Scheme(PICS)-Recommendation on sterility TestingRoutine identificati

8、on of environmental microorganisms to at least the genuslevel should assist in detecting trends.FDA Guide to Inspections of microbiology Pharm ceuticalQuality Control LaboratoriesThe importance of identifyin all isolates from either or both otal Plate Count testing andenrichment testing will depend

9、upon the product and its intended use. Obviously, if anoral solid dosage form such as a tablet is tested, it may be acceptable to identify isolateswhen testing shows high levels. However, for other products such as topicals, inhalants ornasal solutions w ere there is a major concern for microbiologi

10、cal contamination, isolatesfrom plate counts, as well as enrichment te ing, should be identified.PDA TECHNICAL REPORT NO. 13Characteriz tion of Isolates:Characterizing microorganisms recovered from environmentalRevised Fundamentals of an Environmental Monitoring programandonnel monitoring is an impo

11、rtant part of surveillance programs.DocumentRecommendationUSP , ChP, EP , JP 结果判断：对阳性结果进行鉴定并调查，排除实验污染无菌检查法USP , ChP, EP , JP 其他检出的潜在危害微生物评估非无菌产品微生物限度检查：标准USP , ChP, EP , JP 疑似菌确认非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查USP微生物控制和无菌过程环 监控IDENTIFICATION OF MICROBIAL ISOLATES：A successful environmental control program include

12、san appropriate level f identification of the flora obtained by sampling. A knowledge of the flora incontrolled environments aids in determining the usual microbial flora anticipated for the facility and inevaluating the effectiveness of the cleaning and sanitization procedures, methods, agents, and

13、 recoverymeth ds. The information gathered by an identification program c n be useful in the investigation of thesource o contamination, especi lly when recommended detectio frequencies are exceeded.Identif cation of isolates from critical and immediately adjacent areas should take precedence overen

14、tification of microorganisms from noncritical areas. Identification methods should be verified, andready-to-use kits should be qualified for their intended purpose.USP制药用水In addition to the e um ration of the bioburden in the water, there is a need to identify and/or select certainm robial species t

15、h could be detrimental to pro ucts or processes.The efore, it is ndustry practice to identify the microorganisms in samples that yield results exceedingestablished Alert and Action Levels. It is also of value to periodically identify the normal microbiome in awaterm, even if counts are below establi

16、shed Alert Levels.USP非无菌产品微生物载荷控制In most nonsterile hygienic assessments, characterization of he microorganisms, cellular morphology,G m reaction, a simple diagnostic testing are sufficient.USP,EP, JP生物指示剂Where identification of the BI species is deemed necessary, as in the course of an investigatio

17、n into unusualresults, use either aypic or genotypic identification method (see Microbial Characterization,Identification, and Stra Typing for additio al information).1.制药环境微生物微生物鉴定应用于药品生产的各个过程中，扮演着工具的角色，通常FDA鲜有单独针对微生物鉴定的警告信。 对于非无菌产品未按照21 CFR 211.113（a）中要求建立并遵循控制不可接受微生物的程序。如：环境监控记录中在产品接触表面检出革兰氏阴性细菌，

18、但企业并未对其进行鉴定以判断其是否不可接受微生物。 对于非无菌产品未按照21 CFR 211.113（a）中要求建立并遵循控制不可接受微生物的程序。如：没有对空气样品分离微生物的鉴定记录。 缺少对于微生物污染原因充足的调查证据，也未在每次测试期间保持完整的记录。如：企业对于483警告信的回复中申诉：对预糊化淀粉中分离出的一株微生物进行了鉴定，但FDA并未找到能够证 这次鉴定的证据。 对于无菌产品未按照21 CF 211.113 b）中的要求建立并遵循防止微生物污染的程序。如：FDA建议企业提供委托独立第三方分析实验室进行的鉴定和分型结果。National Institutes for Food

19、 and Drug Control1.制药环境微生物食品 低营养、低水分 防腐剂、消毒剂、杀菌剂 非适宜生长环境临床药品 生长代谢缓慢 与外界的物质交换不活跃 表型特征不典型（形态、生理生化）微生物生长繁 条件逐渐严苛National Institutes for Food and Drug Control1.制药环境微生物设备空气 Pseudomonas spp.假单胞菌（潮湿含水表面） Staphylococcus epidermidis 表葡 Bacillus spp. 芽孢杆菌 Micrococcus spp.微球菌 Bacillus spp. 芽孢杆 Staphylococcus s

20、pp. 球菌 Corynebacterium s p. 棒状杆菌 Aspergillus spp. 曲霉 Cladosporium spp. 枝孢属，Stachybotrys spp. 葡萄穗霉属,and Aureobasidium pullulans出芽短梗霉属 Aspergillusspp.曲霉, Penicillium spp. 青霉制药环境 Penicillium spp. 青霉人员 Staphylococcus spp.葡萄球菌 Micrococcus spp.微球菌 Acinetobacter spp.不动杆菌 Alcaligenes spp. 产碱杆菌 Pseudomonas s

21、pp.假单胞菌 Alcaligenes .产碱杆菌属水系统 Stenotrophom s spp.寡养单胞菌 Burkhold ia cepaci 洋葱伯克霍尔德菌 Burkhol eria picketti 皮氏伯克霍尔德菌 Methylobacterium 甲基杆菌属 Serratia spp.沙雷氏菌 Lipophilic yeasts 亲脂性酵母菌 Der atophyte fungi 皮肤真菌National Institutes for Food and Drug Control Flavobacterium spp.黄杆菌1.制药环境微生物第三方检测实验室对收集到的微生物进行鉴定

22、，结果类群统计，出现频率大于1%的15个种占到超过50%的比例。Gram-positive coccus: 31.4%Gram-positive, spore-forming rod: 13.3%Pleomorphic Gram-positive rod: 3.7%Gram negative rod: 1.7%National Institutes for Food and Drug Control1.制药环境微生物23.70%28.80%4.30%5.80%19.40%6.50%11.50%葡萄球球菌属 微球菌属 芽孢杆菌属 微杆菌属 不动杆菌属 假单胞菌属 其他nal Institutes

23、 for Food and Drug Control主要内容制药环境微生物微生物分离鉴定技术鉴定技术应用National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术比较:与微生物鉴定系统中的标准参考微生物（模式菌株、标准菌株或经过确认的菌株等）的特征（基因型和/或表型）相匹配。QUERYDATABASENational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术 微生物鉴定：指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程。

24、（ChP 9204 微生物鉴定指导原则） Microbial identification: The determination of which broad group(e.g., bacteri yeast, or mold) or narrow group (e.g., genus and/orspecies) to which a laboratory isolate belongs.（USP 1113）National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术分类依据 鉴定依据Polyphasic taxonomy：1970年Co

25、lwel 提出将所有可以获得的表型、基因型和化学信息整合在一起，建立普遍适用于 有细菌的分类方案。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术1969年，美国科学家R.H.Whittaker在原有的四界基础上，提出“五界学说”，被广泛接受。界1977年Carl W se对大量微生物的16S及18S rRNA进行测序并比较同源性，提出“三域学说”。域2.微生物分离鉴定技术-Phylum/Division 门-Domain 域-Kingdom 界Eury rchaeotaCrena chaeota古细菌真细菌变形菌门厚壁菌门放线菌

26、门原核生物域原生生物真菌真菌在各个分类层级之间增加了亚单位来进一步完善分类。真核生物域植物霉菌和酵母不是分类学上的名称动物National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术大肠埃希菌（Escherichia coli）如何得知微生物的分类学信息？-Domain 域-Kingdom 界-Phylum/Divisio 门-Class 纲-原核生物-真细菌-变形菌门-变形菌纲-肠杆菌目-肠杆菌科-埃希菌属 细菌、真菌的分类数据库 权威的分类学鉴定专著-Order 目-Family 科-Genus 属-Species 种-大肠埃希菌Nati

27、onal Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术 鉴定水平：视情况a 大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，落形态，细胞形态，革兰氏染色及关键生化反应；b 非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属药典规定水平；c) 无菌试验结果阳性和、无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败、环境严重异常事件时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平。（ChP 9204）National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术 微生物鉴定：指借助现有的分类系统，通过对未知

28、微生物的特征测定，对其进行大类的区分，或 及 水平确定的过程。（ChP 9204 微生物鉴定指导原则）生化组分基因基因分型菌落观察镜检National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术初筛试验初步确定待检微生物基本特征；进行大类的区分，为后续鉴定方法的选择提供方向表型鉴定通过各种手段对待检微生物的生理生化、化学成分、能源利用、抗逆性等特征进行鉴别获得准确鉴定结果的 提基因型鉴定基于基因水平 鉴定手段，基因型相对受外界环境影响小，与微生物生长代谢活性关联较弱National Institutes for Food and Drug C

29、ontrol2.微生物分离鉴定技术 分离纯化：挑取待检菌株在适宜的培养基上连续划线，以获取纯培养物（单菌落）。从药物原材料、制药用水、生产环境、中间产物和终产品中检出的受损微生物，应在适宜条件下多次传代以恢复稳定状态。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术 培养基 培养基性状：液体（定性）、固体（观察鉴定）、半定量（运动） 培养基营养：水、碳源、能源、氮源、矿物质、生长因子、PH 培养基种 选择性、指示性 温度 嗜温：20-45 嗜热：50+ 嗜冷：15-National Institutes for Food and

30、Drug Control2.微生物分离鉴定技术 形态观察 颜色：白、奶油、红、绿、棕、黄 形状：圆、圆 边缘锯齿、扩散、丝状 表面：光滑、完整、 浪、分支、叶状、模糊 高度：扁平、凸起、水滴 、火山口状、不规则National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术2.微生物分离鉴定技术链格孢属篮状菌属镰孢菌属National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术染色、镜检表型鉴定生化组分鉴定技术序列分析基因型鉴定 核糖体分型PFGE、WGSNational Institutes

31、for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术表 中药饮片污染微生物数据库构建使用鉴定方法统计鉴定单位 数量（株）鉴定方法中检院四川66534316S RNAMALDI-TOF MSMALDI-TOF MS，API，VITEK，16SrRNA广西283浙江陕西1818773MALDI-TOF M ，16S rRNAVITEK，BIOLOVITEK，API河北黑龙江上海31264VITEKVITEK，16S rRNAVI EK辽宁合计1693/National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术 Microbi

32、al characteriza ion: The use of colony growth, celluar morphology, differentstaining, and key diagnos ic features to characterize a laboratory isolate for trendingand investigative purposes without identification, e.g., nonpathogenic Staphylococci. 初筛试验a) 培养物特征b) 染色镜检（或氢氧化钾拉丝试验c) 重要生化试验National Inst

33、itutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术革兰氏染色法：1884年由丹麦病理学家C.Gram 芽胞染色法：芽胞壁结构致密，通透性低，不所创立，用于区分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴 易着色，在革兰氏染色中呈透明状。难着色，性细菌。难脱色。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术1min1min10-20sa) 操作b) 对照c) 菌龄1minG-G+芽胞染色National Institutes for Food and Drug Control革兰氏染色2.微生物分离鉴定技术 什么时

34、候需要染色？ 大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，菌落形态，细胞形态 革兰氏染色及关键生化反应； 生化鉴定 前 分离纯化效果 酵母&细菌National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术2.微生物分离鉴定技术真菌的显微观察-酵母National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术真菌的显微观察-霉菌 玻片培养法培养基载玻片盖玻片霉菌孢子悬液滤纸培养、观察平皿National Institutes for Food and Drug Control2.微生

35、物分离鉴定技术重要生化试验：a) 氧化酶试 在分子氧参与下，将细胞色素C氧化，进而将对苯二胺氧化为紫色的醌类物质。b) 过氧化氢酶：将H O 解为H O和O ，产气泡。222c) 凝固酶：使含有肝素等抗 剂的人或兔等血液发生凝固。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术染色、镜检表型鉴定生化组分鉴定技术序列分析基因型鉴定 核糖体分型PFGE、WGSNational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术自动手动生化鉴定National Institutes for F

36、ood and Drug Control2.微生物分离鉴定技术数值分类法：20世纪60年代，随着计算机的应用而将数值分类引入了细菌分类，一般选用50项以上的细菌生理、生化指标，借助计算机分析各菌间的相似度，以此来划分种和属。包含的试验类型： 常 生化 胞外酶实验：无需微生物生长，凭分泌到细胞外的酶显示颜色 糖发酵（ 化）试验：含糖类及PH指示剂，检测利用碳源的形式 同化试验：利用仅含单一碳源的培养基检测微生物对唯一碳水化合物或醇类的利用能力 抑制试验： 利用抗生素、毒性底物检测微生物的生长与否和被抑制的程度National Institutes for Food and Drug Contro

37、l2.微生物分离鉴定技术National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质反应导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的 度差异。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术71 Carbon Source + 23Chemical SensitivityAssays Gen II

38、I 鉴定板：好氧 菌(包括部分兼性厌氧菌) AN鉴定板：厌氧菌 YT鉴定板：酵母 FF鉴定板：丝状真菌 大部分为霉菌，含部分假丝酵母)National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术纯培养接种读数GENE：可边培养边读数，也可终点读数AN& YT& FF ：终点读数制备菌悬液GENE：90-98%T；62- %TAN：65%T 2%YT：47%T 2%FF：75%T 2%培养GENE：33N：35-37National Institutes for Food and Drug Control& FF：262.微生物分离鉴定技术Na

39、tional Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术染色、镜检表型鉴定生化组分鉴定技术序列分析基因型鉴定 核糖体分型PFGE、WGSNational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱MALDI-TOF MS 微生物细胞中核糖体蛋白指纹图谱 MALDI是1987年以后由F.Hille kamp和K.Tanaka等人正式确立的“软电离” 方法，基质辅助电离方式对样品的破坏性小,质量测定范围大,分子量测定准确。National Institutes

40、for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术纯培养样品制备测定结果分析得分结 解释2.000-3.0001.700-1.999种水平属水0.000-1.699 没有可信的鉴定结National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR ） 通过红外光谱读取微生物菌体细胞壁、细胞膜及细胞内所有组成成分化学键的振动情况,提供整个微生物菌体生化组成成分的光谱定量信息。标 示谱段(cm-1)3000-2800180

41、0-15001500-1200振动类型代表的细胞组分CH伸缩振动区酰氨（、 ）区混合区细胞膜脂肪酸细胞蛋白和肽类，DNA、RNA结构白质和脂肪酸，磷酯 1500-1400二级脂肪酸区C-O伸缩振动区指纹区两性细胞质膜成分（蛋白质和类脂）National Institutes for Food and Drug Control1200-900900-700细聚糖长链 肪酸2.微生物分离鉴定技术点样纯培养制备菌悬液测定数据处理National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术环境菌National Institutes for Food

42、 and Drug Control2.微生物分离鉴定技术表型鉴定小结： 范围：细菌&真菌 优势：时间、通量、成本 局限：原理、数据库National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术染色、镜检表型鉴定生化组分鉴定技术序列分析核糖体分型PFGE、WGS基因型鉴定National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术表型基因 现有的分类体系保守、稳定 数据库National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术Nation

43、al Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术 FDA Guidance for Industry- Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current GoodManufacturing PracticeGenotypic methods have been shown to be m re accurate and precise than traditional biochemicaland phenotypic techniques. These methods

44、are especially valuable for investigations into failures(e.g., sterility tes ; media fill contamination). However, appropriate biochemical and phenotypicmethods can be ed for the routine dentification of isolates.National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术染色、镜检表型鉴定生化组分鉴定技术序列分析基因型鉴定 核糖体分

45、型PFGE、WGSNational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术16S rRNA 保守性&可变性 普遍性23S+5S+34protein 长 适宜21proteintRNA16S3S5SInstitutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术真菌核糖体rRNAHypervariable domainSSU: Sma SubunitIntergenic spacer18S5.8sD125-28S5SD2SU Large SubunitITS: I ernal transcribed space

46、r 18S多用于属以上的分类学定位及系统发育分析。 ITS区多用于真菌的鉴定。Candida, Cryptococcus， richosporon（丝孢酵母属），Aspergillus D1/D2区是位于LSU中的 变区，常与ITS联用进行真菌鉴定。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术recA: Mycobacterium & BurkholderiarpoB: 350&450bprecN: Streptococcus & E. coli &Neisseria gonorrhoeaeSingle copyOthers:

47、 ppk, dnaj, gapA, pyrH, luxABE,ectBC, dnaA, pheS and dnaKrpoDRNA聚合酶Frankia & E coli.RPB1：Basidiomycota, zygomycota,Microsporidia-tubulin: PenicilliumTEF -1：FusariumrporpoCMycobacterium tuberculosisEnterococcus & La tic acid ba teriagyrA: B lus subtilis groupDNA螺 酶看家基因（housekeeping genes）：机体细胞中持续表达的一

48、类基因，维持细胞基本功能所必需，通常在所有细胞中均表达，且不受细胞状态影响。常作为其他基因表达水平的参照。National Institutes for Food and Drug ControlgyrB: Bacillus cereus group2.微生物分离鉴定技术产物验证纯培养核酸提取特异性扩增比对测序纯化National Institutes for Food and Drug Control系统发育分析2.微生物分离鉴定技术01核酸提取 G-& G+ 酵母 丝状真菌0203特异性扩增 体系 退火温度物验证、质控 阴性对照 合适的marker 纯化National Institute

49、s for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术04测序、比对 测序产物质控 比对数据库、参数05遗传距离、系统发育分析National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术n 优势：成本低数据库重复性好n 点：分辨率（某些种间保守性强）基因名称序列长度16S rRNA1.5kbgyrB1.21.4kb碱基替换率 1%/5000万年0.7%0.8%/100万年编码蛋白 否DNA促旋酶B亚基功能核糖 组成成分DNA复制及超螺旋结构维持National Institutes for Food and Drug C

50、ontrol2.微生物分离鉴定技术16S rRNA 系统发育树（芽孢杆菌）National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术gyrB 系统发育树（芽孢杆菌）National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术 Strain typing: Strain typing is an integral part of epidemiological investigat

51、ions in clinical andpublic health microbiology. Methods including pulsed-field gel electrophoresis, ribotyping,arbitrarily primed polymerized chain reaction, and whole genome ordered restriction or opticalmap ng can be used to demonstrate that microbial species are the same strain and most likely ar

52、efrom a common sourse.（USP 1113）菌株A菌株BNational Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术核糖体分型（Ribotyping） 核糖体DNA在不同菌株中的拷贝数存在差异。 限制性内切酶对细菌基因组进行酶切，菌株之间的酶切片段长度、数量存在差异，经特异性探针标记，形成菌株专一的指纹图谱。National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴

53、定技术纯培养制备菌悬液热处理，DNA制备SIM0.85则与鉴定结果同种，SIM0.9则与鉴定结果同一核糖体型。图谱获取National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE） 用于大分子DNA的分离，通过不断改变电场的方向，使得包埋在琼脂糖凝胶中的DNA随之改变泳动方向，DNA分子的大小将决定其在电场中的运动位置差异。 分离 小1kb10Mb的DNA分子，对象为整个基因组。 重复性好、分辨力强，被誉为细菌分子学分型的“金标准”。Salmonell

54、a、Sta ylococcus aureus、Streptococcuspneumoniae、Cl tridium difficile、Klebsiella、Acinetobacte baumann裂解，去除RNase,蛋白质限 性酶消化菌体包埋电泳结果分析National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术全基因组测序（Whole genome sequencing，WGS） 细菌基因组一般不超过10Mb，真菌基因组2Mb80Mb。nstitutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术基因型鉴定

55、小结： 范围：细菌&真菌 优势：数据库，溯源 局限National Institutes for Food and Drug Control2.微生物分离鉴定技术-总结鉴定方法a) 原理/目的b) 数据库：影响鉴定准确性的关键因素c) 可操作性d) 定性：可重复性e 成本National Institutes for Food and Drug Control主要内容制药环境微生物微生物分离鉴定技术鉴定技术应用National Institutes for Food and Drug Control3. 鉴定技术应用多相鉴定Polyphasic taxonmy: Taxonmy that as

56、sembles and assimilates many levels of informationfrom molecular, physiological, morphological, serological, or ecological sources toclassify microorganism.（USP1113） 正交性（orthogonal）：不同的鉴定方法针对微生物不同的组分或活性进行测定。 无序性（not seq ntial）：并非选取某一种方法，未得到鉴定结果，然后再去实验另一种方法以 得结果 所有的方法都是同时进行，以提供充分的信息以达到鉴定目的。National I

57、nstitutes for Food and Drug Control3. 鉴定技术应用 在实践应用中，应用场景和成本限制了多相分类鉴定的应用 根据实际需求，按照顺序，叠加使用鉴定方法达到鉴定目的 微生物鉴定技术用户需求 经验证的数据库：局限、更新 成本：经济、时间、人员 样品制备： 否需要前期染色镜检结果、是否对培养条件有限制 鉴定范围：考虑日常需鉴定微生物种类 分型能力：考虑溯源调查需求 报告： 是否能够鉴定真菌National Institutes for Food and Drug Control3. 鉴定技术应用设备空气 Pseudomonas spp.假单胞菌（潮湿含水表面） Cl

58、adosporium spp. 枝孢属，Stachybotrys spp. 葡萄穗霉属,and Aureobasidium pullulans出芽短梗霉属 Aspergillusspp.曲霉, Penicillium spp. 青霉制药环境 Corynebacterium s p. 棒状杆菌 Aspergillus spp. 曲霉 Penicillium spp. 青霉人员 Acinetobacter spp.不动杆菌 Alcaligenes spp. 产碱杆菌 Lipophilic yeasts 亲脂性酵母菌 Der atophyte fungi 皮肤真菌 Pseudomonas spp.假

59、单胞菌 Alcaligenes .产碱杆菌属水系统 Stenotrophom s spp.寡养单胞菌 Burkhold ia cepaci 洋葱伯克霍尔德菌 Burkhol eria picketti 皮氏伯克霍尔德菌 Methylobacterium 甲基杆菌属 Serratia spp.沙雷氏菌National Institutes for Food and Drug Control Flavobacterium spp.黄杆菌3. 鉴定技术应用 Ribotyping PFGE菌株3无菌检查阳性、模拟灌装rRNA测序（某些种如M. aloeverael&M. yunnanensis无法区分

60、）+DNA杂交A/B级区、无菌检查阳性、模拟灌装种水平2 16S rRNA 革兰氏染色+自动生化 MALDI TOF属/种水平1常规环境监测，非关键区域Micrococcus spp.National Institutes for Food and Drug Control3. 鉴定技术应用 Ribotyping PFGE菌株3无菌检查阳性、模拟灌装 16S rRNA测序+housekeeping gene（gyrB）培养基+11种生化（针对B.cereus group） MLSTA/B级区、无菌检查阳性、模拟灌装种水平2 16S rRNA测 革兰氏染色+自动生化 MALDI TOF属/种水平