定量PCR实验要素和数据处理

1、定量PCR实验要素及数据处理王争强Hotline: 400 620 9660cnmcbsupport实验要素 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.实验要素zzzz目标基因样品标准曲线标准品阳性对照阴性对照监控系统故障监控污染zzz校准生物学误差校准物理误差降低随机误差内参(管家基因)参比荧光重复实验 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.模板质量及浓度z DNA纯度：OD /OD =1.8，1.6-2.0之间260280z DNA用量：0.1ng-100ngz RNA纯度：OD /OD =

2、2.0260280z cDNA用量：10-100ng 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.标准品z 目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系z 要求： 浓度已知 5个及5个以上标准品 标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100% 仪器质量一致 试剂质量一致：模板纯度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓冲液成分 反应条件一致：循环参数相同、同一次实验 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.标准品梯度稀释方法z 选择目标提取/PCR 纯化测定浓度调整浓度梯度稀释z Ct值在18-30

3、之间，覆盖全部样品浓度区间z 10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv1v 标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.标准品单位z 标准品的单位决定定量结果的单位z 根据最终目的选择标准品单位 如果要求测定样品的基因拷贝数，则梯度稀释已知摩尔浓度的DNA片段 如果要求测定样品的重量百分比%(w/w)，如

4、转基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合DNA；切不可先抽好转基因DNA，再梯度稀释，也不可分别抽提转基因与非转基因DNA，再按重量比例混合（这样得出的是基因重量百分比，而不是样品重量百分比） 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.PCR效率的测定K=-1/log(1+E) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.PCR效率对定量结果的影响n = 301+E = 1.95Y = X 1.9530 = X x 5.0 x 108相差2.2倍n = 301+E = 1.

5、90Y = X 1.9030 = X x 2.3 x 108Y=扩增产物，X=起始浓度，E=扩增效率，n=循环数 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.Question？ 标准品DNA与目标DNA必须是一样的吗？ 当检测多个基因时，需要分别做标准曲线吗？ 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.阳性对照z 内参(管家基因)z 标准品 线性范围 灵敏度 扩增效率z 外源阳性内对照z 来源 PCR产物 质粒 阳性样本 2009 Applied Biosystems. All Rights Rese

6、rved.阴性对照z 实验效果验证z 种类 No Template Control No RT Control No Probe Controlz 如何分析 电泳 融解曲线 测序 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.内参(管家基因,Endogenous Control)为什么需要阳性内对照(IPC)?z 内参用于校准实验过程对定量结果的影响 核酸提取时通常以重量或体积为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源于等量细胞（或基因组） 将定量结果校正为以细胞（或基因组）为单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：目的基因/内

7、参=均一化的目的基因表达量z 内参可以起到阳性对照的作用，以监控反应系统是否正常试剂、PCR程序、荧光采集、是否存在抑制物 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.内参的选择z 在所有待测样品中，内对照的表达量都应当恒定不变z 内参常选用管家基因，如18S rRNA、-actin、GAPDH等z 使用Human Endogenous Control Plate (PN：4309920)测试，从中选择合适的管家基因 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.Question？在使用TaqMan MG

8、B探针的情况下，你认为管家基因与目标基因是在同一管内做多重定量好，还是分成两管分别定量好？哪一种检测的数据更精确？ 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.参比荧光z Master Mix中Rox浓度固定z ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关z ROX的功能：耗材质量（如管盖厚度、透光性能）、仪器稳定性（如孔间、批间波动）等的误差，反应体系监控(蒸发)ReporterR = R / RnFAMROXReporterReferenceRnRnReference 2009 Applied Biosystems. All

9、 Rights Reserved.ROX校准增加数据精度 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.重复实验z 样品和标准品都要重复z 重复次数须遵循统计学要求z 小样本统计n6 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.误差的校正z 生物学方面的误差：内参校正细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等z 物理方面的误差：ROX校正耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等，反应体系监控（蒸发）z 随机误差：统计校正重复实验，取平均值

10、2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.数据处理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.绝对定量与相对定量绝对定量相对定量600个拷贝相差10倍 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.绝对定量与相对定量z 绝对定量Copy #10000900080007000 优点：给出目标基因的绝对数量，数据容易处理10000 缺点：必须有标准品，做标准曲线，难以制备和质控60005000400030002000100050000Sample 1Sampl

11、e 2z 相对定量Fold Chg2 优点：可以不做标准品；相对标准曲线法的标准品容易制备；使用广泛21.751.5 缺点：数据理解困难1.25110.750.50.250Sample 1Sample 2 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.绝对定量：绝对标准曲线法1250 copies2500 copies5,000 copiesUnk1 Ct=24.810,000 copies20,000 copiesUnk1浓度=4000 拷贝 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.绝对定量：数据处

12、理如果需要对不同样本的绝对定量数据进行比较，则需内参校准IL-218S目标基因管家基因如 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.绝对定量：样品设置标准品阳性内对照阴性对照样品 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相对定量z 相对标准曲线法z 比较Ct法（CT法） 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.绝对定量：数据处理z 管家基因校准(Normalization Gene) 得出每个细胞中的目的基因 目标基因 vs.管家基因目标基因管家基

13、因IL-218S如z 对照样品校准(Calibrator Sample) 得出相对于某个样品的基因表达量SampleCalibrator处理后处理前如 处理的 vs. 未处理的，6 hr vs.0 hr, 病理vs. 正常. 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相对定量：相对标准曲线法1/16 a1/8 aUnk2 Ct=25.8 aUnk1 Ct=24.8 aaUnk1 浓度= 0.2 aUnk2 浓度= 0.1 a相差2倍标准品只知道稀释倍数 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相对

14、定量：比较Ct法R2-Ct 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相对定量：比较Ct法IL-2 18S DCtDDCt 2-DDCtT=0 (calibrator)T=1hrT=6hr24 9 1524 10 1423 11 1228 10 180 1.0-1 2.0-3 8.03 0.1T=24hr1088.0t = 06t = 1 ht = 6 ht = 24 h42.00.1120 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相对定量：比较Ct法 2009 Applied Biosystem

15、s. All Rights Reserved. CT法要求PCR效率一致且接近100%，标准曲线法没有这样的要求，对不对？ 相对定量要做管家基因吗？ 相对定量要做重复实验吗？ 加样量不同，相对定量的结果会随之改变吗？ 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.Ct值与相对定量结果总RNA多总RNA少BABAthresholdthreshold10 1525 30CT=5CT=5循环次数只要PCR效率相同，CT 就保持恒定 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.结果评价 2009 Applied

16、Biosystems. All Rights Reserved.注意事项 实验室分区：样品处理区、PCR反应制备区、扩增区 标准品的稀释最好使用独立的一套移液器 标准品的稀释液中最好含有Carrier RNA 移液器使用带滤芯的吸头 先阴性对照样，后加样品，再加低浓度标准品，最后加阳性对照 PCR管上不可用记号笔标记 PCR管使用平盖或光膜，不要裸手触摸光盖或光膜表面 PCR管或8联排管要对称放置 反应后的PCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启 采用UNG防污染系统，消除前次扩增产物的污染影响 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.分析流程查验扩增曲线检查/ 调整基线检查/ 调整阈值检查NTC检查 阳性对照检查 样品数据分析特定的实验结果 2009 Applied Bi