生物检定统计法

1、2020年版第二次征采建议稿1431生物检定统计法一、总则生物检定法是利用生物体包含整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在必定条件下比较供试品和与其相当的标准品或比较品所产生的特定反应，经过等反应剂量间比率的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。生物检定统计法主要表达应用生物检准时一定注意的基本源则、一般要求、实验设计及统计方法。相关品种用生物检定的详尽实验条件和要求，一定依据该品种生物检定法项下的规定。生物检定标准品凡中国药典规定用生物检定的品种都有它的其

2、生物检定标准品(S)。S都有标示效价，以效价单位(u)表示，其含义和相应的国际标准品的效价单位一致。供试品供试品(T)或(U)是供检定其效价的样品，它的活性组分应与标准品基实情同。AT或Au是T或U的标示量或预计效价。等反应剂量比较生物检定是将T和其S在相同的实验条件下同时对生物体或其离体器官组织等的作用进行比较，经过比较，计算出它们的等反应剂量比值，以测得T的效价PT。R是S和T等反应剂量(dS、dT)的比值，即R=dSdT。M是S和T的对数等反应剂量(xs、xT)之差，即M=lgdSlgdT=xs-xT。R=antilgM。PT是经过检定测得T的效价含量，称T的测得效价，是将效价比值(R)

3、用T的标示量或预计效价AT校订以后而得，即PT=ATR或PT=ATantilgM。检准时，S按标示效价计算剂量，T按标示量或预计效价(AT)计算剂量，注意调理T的剂量或调整其标示量或预计效价，使S和T的相应剂量组所致的反应程度周边。生物变异的控制生物检定拥有必定的实验偏差，其主要本源是生物变异性。所以生物检定一定注意控制生物变异，或减少生物变异自己，或用适合的实验设计来减小生物变异对实验结果的影响，以减小实验偏差。控制生物变异一定注意以下几点：生物本源、饲养或培育条件一定均一。对影响实验偏差的条件和因子，在实验设计时应尽可能作为因级限制，将采用的因级随机分配至各组。比方体重、性别、窝别、双碟和

4、给药次序等都是12020年版第二次征采建议稿因子，不一样体重是体重因子的级，雌性、雄性是性别因子的级，不一样窝的动物是窝别因子的级，不一样双碟是碟间因子的级，给药先后是次序因子的级等。按程度划分的级(如动物体重)，在选级时，应选动物许多的周边几级，不要间隔跳越选级。按实验设计种类的要求将限制的因级分组时，也一定严格遵守随机的原则。偏差项指从实验结果的总变异中分去不一样剂量及不一样因级对变异的影响后，节余的变异成分，用方差(s2)表示。关于因实验设计种类的限制没法分其余变异成分，或预计某种因级对变异的影响小，可不予分别者，都并入s2。但剂间变异一定分别。偏差项的大小影响标准误SM和可信限(FL)

5、。不一样的检定方法和实验设计种类，分别按相关的公式计算s2。靠谱性测试：平行线检定要求在实验所用的剂量范围内，对数剂量的反应（或反应的函数）呈直线关系，供试品和标准品的直线应平行。靠谱性测试即考据供试品和标准品的对数剂量反应关系能否明显偏离平行偏离直线，对不是明显偏离平行偏离直线（在必定的概率水平下）的实验结果，以为靠谱性成立，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。要求在实验所用的剂量范围内，剂量或对数剂量的反应（或反应的函数）符合特定模型要求，且供试品与标准品的线性满足计算原理的要求；即满足系统适用性和样品适用性要求，方可按相关公式计算供试品的效价和可信限。如：平行（直）线模型要求其在所用

6、剂量范围内，对数剂量与反应（或反应的函数）呈直线关系，供试品和标准品的直线满足平行性要求；四参数模型要求其在所用剂量范围内，对数剂量与反应（或反应的函数）呈S曲线形关系，供试品和标准品的S形曲线平行；质反应资料要求其在所用剂量范围内，对数剂量与反应（或反应的函数）呈S曲线形关系，供试品和标准品的S形曲线平行。可信限和可信限率可信限(FL)标记检定结果的精良度。M的可信限是M的标准误SM和t值的乘积(tSM)，用95的概率水平。M+tSM是可信限的高限；M-tSM是可信限的低限。用其反对数计算得R和PT的可信限低限及高限，是在95的概率水平下从样品的检定结果预计其真实结果的所在范围。R或PT的可

7、信限率(FL)是用R或PT的可信限计算而得。效价的可信限率为可信限的高限与低限之差除以2倍均匀数(或效价)效价（均匀值）T1均值后的百分率。可信限高限-可信限低限FL%100%效价(均匀值）计算可信限的t值是依据s2的自由度(f)查t值表而得。t值与f的关系见表一。注：可信限是可信推测的术语，现一般不再采用；目前统计使用的是概率推测法，用置信区间表达变22020年版第二次征采建议稿异性。中国药典所用的可信限与置信限所表述的意义一致。表一自由度（f）及对应的双侧t值(P=0.95)ftft33.18142.1542.78162.1252.57182.162.45202.0972.37252.06

8、82.31302.0492.26402.02102.23602.00112.201201.98122.181.96各品种的检定方法项下都有其可信限率的规定，假如检定结果不符合规定，可减小动物体重范围或年龄范围等生物样本间的差异，或调整对供试品的预计效价或调理剂量，重复实验以减小可信限率。对同批供试品重复试验所得n次实验结果(包含FL超出规定的结果)，可按实验结果的合并计算法算得PT的均值及其FL作为检定结果。二、直接测定法直接测得药物对各个动物最小效量或最小致死量的检定方法。如洋地黄及其制剂的效价测定。xS和xT为S和T组各只动物的对数最小致死量，它们的均值xs和xT为S和T的等反应剂量，nS

9、和nT为S和T组的动物数。1效价计算32020年版第二次征采建议稿(1)(3)式计算M、R和PT。MxsxT(1)Rantilg(xsxT)antilgM(2)PTATR(3)2偏差项及可信限计算(4)(8)式计算s2、SM及R或PT的FL和FL。x2(xs)2x2(xT)2snsTnTs2nsnT2f=nS+nT-2，用此自由度查表一得t值。SMs2nsnTnsnTR的FL=antilg(MtSM）antilg(M+t.SM)是R的高限antilg(M-t.SM)是R的低限PT的FL=ATantilg(MtSM)AT.antilg(M+t.SM)是PT的高限AT.antilg(M-t.SM)

10、是PT的低限(4)(5)(6)(7)R(或P)的高限-R(或P)的低限TTR(或PT）的FL%=2R(或2PT)(8)当两批以上供试品（T、U）和标准品同时比较时，按（9）式计算S、T、U的合并方差s2。xs2(xs)2xT2(xT)2xU2(xU)2.nsnTnUs21nT(9)ns1nU1.42020年版第二次征采建议稿fns1nT1nU1.效价PT、PU则是T、U分别与S比较，依据（1）-（3）式计算。3实例例1直接测定法洋地黄效价测定鸽最小致死量(MLD)法S为洋地黄标准品，按标示效价配成l.Ou/ml的町剂，临试验前稀释25倍。T为洋地黄叶粉，预计效价AT=10u/g,配成l.Ou/

11、ml的酊剂，临试验前配成稀释液（125)。测定结果见表1-1。52020年版第二次征采建议稿三、量反应平行线测定法药物对生物体所引起的反应跟着药物剂量的增添产生的量变可以丈量者，称量反应。量反应检定用平行线测定法，要求在必定剂量范围内，S和T的对数剂量x和反应或反应的特定函数y呈直线关系，当S和T的活性组分基实情同时，两直线平行。平行线模型的原理见图1。62020年版第二次征采建议稿图1（3.3）剂量组的平行直线模型本版药典量反应检定主要用（2?2)法、（3?3)法、（4?4）法或(2?2?2)法、（3?3?3)法、（4?4?4）法，即S、T(或U)各用2个剂量组或3个设2个、3个或4个剂量组

12、，统称(k?k)法或(k?k?k)法；假如S和T的剂量组数不相等，则称(k?k)法；前面的k代表S的剂量组数，后边的k或k代表T的剂量组数。一般都是按(k?k)法实验设计，当S或T的端剂量所致的反应未达阈值，或趋于极限，去除此端剂量后，对数剂量和反应的直线关系成立，这就形成了(kk法。比方（3?)3)法设计即可能形成（2?3)法或（3?2)法等。所以，(k?k)法中的k只可能比k多一组或少一组剂量。(k?k)法的计算结果可供重复试验时调理剂量或调整供试品预计效价时参照。无论是(k.k)法、(k?k)法或(k?k?k)法，都以K代表S和T的剂量组数之和，故K=k+k或K=k+k或K=k+k+k。

13、本版药典平行线测定法的计算都用简算法，所以对各种（k?k）法要求：(1)S和T相邻高低剂量组的比值（r)要相等，一般r用(1:0.8)?（1:0.5)，lgr=I。各剂量组的反应个数(m)应相等。平行线测定的实验设计种类依据不一样的检定方法可加以限制的因级数采用不一样的实验设计种类。本版药典主要用下边三种实验设计种类。随机设计剂量组内不加因级限制，相关因子的各级随机分配到各剂量组。本设计种类的实验结果只好分别不一样剂量(剂间）所致变异，如绒促性素的生物检定。随机区组设计将实验动物或实验对象分成区组，一个区组可以是一窝动物、一只双碟或一次实验。在剂量组内的各行间加以区组间（如窝间、碟间、实验次序

14、间）的因级限制。随机区组设计要求每一区组的容量（如每一窝动物的受试动物只数、每一只双碟能容纳的小杯数等）一定和剂量组数相同，这样可以72020年版第二次征采建议稿使每一窝动物或每一只双碟都能接遇到各个不一样的剂量。所以随机区组设计除了从总变异中分别剂间变异以外，还可以分别区组间变异，减小实验偏差。比方抗生素杯碟法效价测定。交织设计同一动物可以分两次进行实验者适适用交织设计。交织设计是将动物分组，每组可以是一只动物，也可以是几个动物，但各组的动物只数应相等。标准品（S）和供试品（T）比较时，一组动物在第一次试验时接受S的一个剂量，第二次试验时则接受T的一个剂量，这样调换交织进行，可以在同一动物身

15、长进行不一样试品、不一样剂量的比较，以去除动物间差异对实验偏差的影响，提升实验精确度，节约实验动物。(2?2)法S和T各两组剂量，用双交织设计，将动物分成四组；对各组中的每一只动物都标上鉴别号。每一只动物都按给药次序表进行两次实验。平行线测定法的方差分析和靠谱性测试随机设计和随机区组设计的方差分析和靠谱性测试(1)将反应值或其规定的函数(y)按S和T的剂量分组列成方阵表见表二。表二平行线模型中的剂量分组方阵表方阵中，K为S和T的剂量组数和，m为各剂量组内y的个数，如为随机区组设计，m为行间或组内所加的因级限制；n为反应的总个数，n=mK。（2）特异反应异常值T2剔除和缺项补足82020年版第二

16、次征采建议稿异常值Office3剔除在同一剂量组内的各个反应值中，如出现特大或特小的数反应值时，应进行异常值检验，个别特大或特小的反应，应按以下方法判断其92020年版第二次征采建议稿能否可以剔除。以确立其能否应被剔除。检验异常值的方法很多，这里介绍建议使用狄克森（Dixon）方法和格拉布斯（Grubbs）检验法。方法1狄克森T4（Dixon）检验法该法仅适于同组中反应值较少时，对此中可疑的离群异常反应值进行检验。该法假定在99%的置信水平下，一个有效的反应值被拒绝的概率仅有1%（异常值出此刻单侧），或2%（异常值出此刻双侧）。yy。假定有同一组中m个观察反应值，依据由小到大的次序进行摆列，1

17、m按表三中的公式对组内可疑的离群异常反应值计算J值。样本量（m）表三狄克森法异常值的J1、J2和J3计算公式当可疑异常值是最小值（y）当可疑异常值是最大值（y）1m3-7J1(y2y1)/(ymy1)J1(ymym1）/(ymy1)8-10J2(y2y1)/(ym1y1)J2(ymym1）/(ymy2)11-13J3(y3y1)/(ym1y1)J3(ymym2）/(ymy2)假如J1、J2、或J3中的计算值超出表四中给出标准值，则判断为异常值，可考虑剔除。当同一组中的观察反应值数目大于13个时，请采用方法2。对一个正态反应的样本，在99%置信水平下，差距不小于表四中J1,J2或J3的值时，其异

18、常值出此刻任一侧的概率p=0.01，在双侧均出现离群反应值的概率为p=0.02。表四剔除异常值的J1、J2和J3判断标准0.01明显性水平下狄克森检验法异常值判断标准mJ1mJ2mJ330.98880.683110.67940.88990.635120.64250.780100.597130.61560.69870.637方法2格拉布斯（Grubbs）检验法该法既可用于同组反应值中的异常值检验，也可用于拥有方差同质时的模型（如直线性模型或非直线性模型）中的残差法检测异常值。本法的计算原理以下：找出本组数据中离样本均值最大的值yi，计算其标准化偏离值Z：i-Y）/S（）Z=（y10102020年

19、版第二次征采建议稿式中Y和S分别是该组数据的均值和标准差。关于使用平行线模型计算获取的残差，则Y=0，；S是试验中的残差均值的平方根，即均方根偏差。当|Z|大于使用以下公式获取的G值时，则以为yi值属于99%置信水平下的一个统计异常值。G(m1)tdf1,pm(m2tdf21,p)G(m1)tm2,pm(m2tm22,p)（11）m为本组数据的样本量，t是在m-2df自由度水平下，拥有S标准偏差的t分布中100p%的单侧值。p10.012m（12）缺项补足因反应值被剔除或因故反应值缺失造成缺项，致m不等时，依据实验设计种类做缺项补足，使各剂量组的反应个数m相等。随机设计对缺失数据的剂量组，以该

20、组的反应均值补入，缺1个反应补1个均值，缺2个反应补2个均值。随机区组设计按（13）式计算的值，补足缺项。（13）式中C为缺项所在剂量组内的反应值总和；为缺项所内行的反应值总和；G为所有反应值总和。假如缺1项以上，可以分别以y1、y2、y3等代表各缺项，而后在计算此中之一时，把其余缺项y直接用符号y1、y2等看作未缺项代入（13）式，这样可得与缺项数相同的方程组，解方程组即得。随机区组设计，当剂量组内安排的区组数许多时，也可将缺项所在的整个区组除掉。随机设计的实验结果中，如在个别剂量组多出1?2个反应值，可按严格的随机原则去除，使各剂量组的反应个数m相等。s2的自由度减去1，缺项不得无论哪一种

21、实验设计，每补足一个缺项，就需把超出反应总个数的5%。方差分析方阵表（表二）的实验结果，按（14)?(21)式计算各项变异的差方和、自由度（f）及偏差项的方差(s2)。随机设计按（14）式、（15）式计算差方和(总)、差方和（剂间）。按（20）式计算差方和（偏差）。按（18）式或（21）式计算s2。随机区组设计按（14）?（17）式计算差方和(总)、差方和（剂间）、差方和(区组间)、差方和(偏差）。按（18）式或（19）式计算s2。112020年版第二次征采建议稿（14）（15）（16）（17）（18）（19）f=(k-1)(m-1)（20）（21）靠谱性测试经过对剂间变异的分析，以测试S和T

22、的对数剂量和反应的关系能否明显偏离平行直线。(2.2)法和（2.2.2）法的剂间变异分析为试品间、回归、偏离平行三项，其余（k?k）法还需再分析二次曲线、反向二次曲线等。靠谱性测试的剂间变异分析（k?k）法、（k?k）法按表四五计算各变异项的及，按(22)式计算各项变异的差方和。122020年版第二次征采建议稿（22）表四五（k?k）法、（k?k）法靠谱性测试正交多项系数表续上表注：用（2.3）法及（3.4）法时，分别将（3.2）法及（4.3）法中S和T的正交多项系数互换即得。表中S1、S2T1、T2在量反应分别为标准品和供试品每一剂量组内的反应值或它们规定函数的总和相当于表二的各项。所有脚序

23、1、2、3都是按序由小剂量到大剂量，Ci是与之相应的正交多项系数。是该项变异各正交多项系数的平方之和与m的乘积，为S1、S2T1、T2分别与该项正交多项系数乘积之和。(k?k?k)法按（23）式、（24）式计算试品间差方和。132020年版第二次征采建议稿按表五六计算回归、二次曲线、反向二次曲线各项变异的及；按（22）式计算差方和（回归）、差方和（二次曲线）。表五六（k?k?k）法靠谱性测试正交多项系数表按（25）式计算差方和(偏离平行)及差方和(反向二次曲线。差方和(偏离平行)、差方和(反向二次曲线=（25）f=2按（18）式计算各项变异的方差。将方差分析结果列表进行靠谱性测试。比方随机区组

24、设计(3.3)法靠谱性测试结果列表，见表六七。表六七随机区组设计（3.3)法靠谱性测试结果表六七中概率P是以该变异项的自由度为分子，偏差项(s2)的自由度为分母，査F值表（表七八），将査表所得F值与表八F项下的计算值比较而得。当F计算值大于P=0.05或P=0.01的査表值时，则P0.05或P0.01，即为在此概率142020年版第二次征采建议稿水平下该项变异有明显意义。随机设计没有区组间变异项。表七八F值表靠谱性测试结果判断靠谱性测试结果，回归项应特别明显(P0.05)。其余(k?k)法、(k?k?k)法偏离平行、二次曲线、反向二次曲线各项均应不明显(P0.05)。152020年版第二次征采

25、建议稿试品间一项不作为靠谱性测试的判断标准，试品间变异特别明显者，重复试验时，应参照所得结果重新预计T的效价或重新调整剂量试验。双交织设计的方差分析和靠谱性测试双交织设计实验结果的方阵表将动物按体重随机分成四组，各组的动物数（m）相等，四组的动物总数为4m。对四组中的每一只动物都加以鉴别标记，按双交织设计给药次序表进行实验，各组的每一只动物都给药两次，共得24m个反应值。将S、T各两个剂量组两次实验所得反应值摆列成表，见表八九。表八九双交织实验结果缺项补足表八九中若有个别组的1个反应值因故缺失，均作该只动物缺失办理，在组内形成两个缺项。此时，可分别用两次实验中该组动物其余各反应值的均值补入；也

26、可在其余三组内用严格随机的方法各去除1只动物，使各组的动物数相等。每补足一个缺项，偏差（）和偏差（）的方差SI2和SII2的自由度都要减去1。缺项不得超出反应总个数的5%。同一组内缺失的动物不得超出只。方差分析双交织设计的总变异中，包含有动物间变异和动物内变异。对表八九的24m个反应值进行方差分析时，总变异的差方和（总）按（26）式计算。（26）动物间变异是每一只动物两次实验所得反应值的和（表九每组动物的第三列）之间的变异，其差方和按（27）式计算。（27）总变异中分除动物间变异，余下为动物内变异。动物间变异和动物内变异的分析将表八九中S和T各剂量组第（1）次实验所得反应值之和S1(1)、S2

27、、T1(1)、T2(1)及第（2）次实验反应值之和S1(2)、S2(2)、162020年版第二次征采建议稿T1(2)、T2(2)按表九十双交织设计正交系数表计算各项变异的及y)，按(22)式计算各项变异的差方和。总变异的差方和减去动物间变异的差方和，再减去动物内各项变异的差方和，余项为偏差（I）的差方和，按（28）式计算。（28）偏差（I）的方差s2，用以计算实验偏差SM、FL,及进行动物内各项变异（表九十中*标记者）的F测试。表九十双交织设计正交系数表各项变异的自由度均为1。有*号标记的四项为动物内变异，其余三项为动物间变异。偏差（)的差方和为动物间变异的差方和减去表九十中其余三项变异（表十

28、九中无*标记者）的差方和，按（29）式计算。（29）偏差（）的方差SII2用以进行上述三项变异的F测试。靠谱性测试将方差分析及F测试的结果列表，如表十一十。表十一十中的概率P，计算同表六七，但表的上半部分是以sII2的自由度为分母，表的下半部分以s2的自由度为分母，查F值表(表八七），将查表所得的F值与表十一十F项下的计算值比较而得。172020年版第二次征采建议稿表十一十双交织设计靠谱性测试结果靠谱性测试结果判断回归、偏离平行、试品间三项的判断标准同（2.2）法。次间试品间、次间回归、次间偏离平行三项中，若有F测试特别明显者，说明该项变异在第一次和第二次实验的结果有特别明显的差异，对出现这类

29、状况的检定结果，下结论时应谨慎，最好复试。效价(PT)及可信限（FL）计算各种（k?k）法都按表十一十二计算V、W、D、A、B、g等数值，代入(30)（33）式及（3）式、（8）式计算R、PT、SM以及R、PT的FL和FL%等。(30)(31)(32)(33)(2?2)法双交织设计计算方法同上述（2?2）法。双交织设计各剂量组都进行两次试验，S和T每一剂量组的反应值个数为组内动物数的两倍(2m)。双交织设计用S和T各组剂量两次试验所得各反应值之和（表九八中的S1、S2、T1、T2)按表十二十一（2?2）法公式计算V、W、D、g等数值。参照(31)式计算SM，因每只动物进行两次实验，式中m用2m

30、取代，（2?2）A=l,B=l,SM的公式为182020年版第二次征采建议稿（34）式中s2为表十十一中偏差（I）的方差：表十一十二量反应平行线检定法的计算公式实例例2量反应平行线测定随机设计(3.3.3)法绒促性素（HCG）效价测定-小鼠子宫增重法为绒促性素标准品dS1:0.135u/鼠dS2:0.225u/鼠dS3:0.375u/鼠T为绒促性素预计效价AT:2500u/mgdT1:0.135u/鼠dT2:0.225u/鼠dT3:0.375u/鼠U为绒促性素粉针，标示量AU:500u/安瓿dU1:0.144u/鼠dU2:0.240u/鼠dU3:0.400u/鼠r=1:0.6I=0.222反应

31、（y）：10g体重的子宫重（mg）测定结果见表2-1。（）法，K=9，每组15只小鼠，m=15192020年版第二次征采建议稿（1）按（14）式、（15）式、（20）式计算各项的差方和差方和=9.3122222（915）=29868.26（总）+17.50+23.80+21.80+36.00-3795.35/f（总）=915-1=134差方和238.682+477.632+?+582.102-3795.352（剂间）=15915=12336.55f（剂间）=9-1=8差方和(偏差)=29868.26-12336.55=17531.71f(偏差)=134-8=126（2）剂间变异分析及靠谱性测试

32、按（24)式及表六五(3.3.3)法分析。差方和（试品间）=(238.68+447.63+623.58)2+(208.74+395.10+526.00)2(315)+(274.92+498.60+582.10)2(315)-3795.352(915)=633.23f(试品间)=2各项分析结果见表2-2、表2-3。结论：回归特别明显，偏离平行、二次曲线、反向二次曲线均不明显，实验结果成立。202020年版第二次征采建议稿(3)效价（PT、PU)及可信限（FL)计算按表十二十一(3.3.3)法及（30)?（33)式、(3)式、（8)式计算。r=l:0.6I=0.222s2=139.14f=126t

33、=1.98Pt及其FL计算：212020年版第二次征采建议稿222020年版第二次征采建议稿3量反应平行线测定随机区组设计(3.3)法新霉素效价测定杯碟法(2)剂间变异分析及靠谱性测试按表五四（3.3)法计算，结果见表3-2、232020年版第二次征采建议稿3-3。结论：回归特别明显（P0.05)，实验结果成立。组内（碟间）差异特别明显（P0.01)，分别碟间差异，可以减小实验偏差。(3)效价（PT)及可信限（FL)计算按表十二十一（3?3)法及(30)?（33)式、（3)式、（8)式计算。r=l:0.8I=0.0969s2=0.006912f=40242020年版第二次征采建议稿4量反应平行

34、线测定随机区组设计(2.2)法缩宮素效价测定大鼠离体子宮法252020年版第二次征采建议稿m=5ya=15y1=13y2=35ym=41y2y13513J1y1410.786ym13查表四，m=5时，J1=0.780，小于计算值0.786，故此值可以剔除。剔除后形成的缺失项按（13）式补足。（3）剂间变异分析及靠谱性测试按表四五（2?2）法计算，结果见表4-2、4-3。262020年版第二次征采建议稿结论：回归特别明显(P0.05),实验结果成立。区组间差异明显（P0.05),分别区组间变异，可以减小实验偏差。缩宫素离体子宫效价测定，如区组间变异不明显，也可以不分别区组间变异，用随机设计方差分

35、析法计算。效价(PT)及可信限（FL)计算按表十二十一(2.2)法及(30)?（33)式、（3)式、(8)式计算。272020年版第二次征采建议稿5量反应平行线测定（2.2)法双交织设计胰岛素效价测定-小鼠血糖法S为胰岛素标准品d：25mu/ml,0.25ml/鼠Sl0.25ml/d：50mu/ml,鼠s2T为胰岛素标示量AT:27u/mgdT1:25mu/ml，0.25ml/鼠d:50mu/ml,0.25ml/鼠T2r=l:0.5I=0.301反应值y:血糖值(mg%)每组用鼠10只，m=10测定结果按表九八摆列，见表5-1。282020年版第二次征采建议稿方差分析按(26)式、（27)式计

36、算：(2)将表5-1中S、T各剂量组每一次反应值之和按表十九及(22)式、（28)式、（29)式、（18)式计算各项变异的、及差方和、方差，并进行靠谱性测试，结果见表5-2、表5-3。292020年版第二次征采建议稿按（28)式、(29)式计算:结论：回归特别明显，偏离平行不明显，实验结果成立。两次实验间的差异特别明显，用双交织设计可以除掉实验间变异对实验偏差的影响，提升实验的精确度。(3)效价（PT)及可信限(FL)计算：用表5-1的S1、S2、T1、T2,按表十二十一（2.2)法及（30)式、(32)?（34)式等计算:302020年版第二次征采建议稿r=1：0.5I=0.301s2-=9

37、9.2778f=36t=2.031V=(1765.96+2158.30-1687.02-2154.87)=41.1852四、四参数回归计算法四参数回归计算法系采用非线性模型进行量反应检定的一种统计分析方法。该法要求在必定剂量范围内，标准品(S)和供试品(T)的对数剂量x与反应值或反应值的特定函数y呈“S”或反“S”形关系，可拟合成四参数逻辑斯蒂（logistic）回归方程，拟合曲线对称于拐点，上下各有一渐进线。当S和T的活性组分基实情同时，两拟合曲线平行。S形量反应四参数逻辑斯蒂（logistic）曲线模型图见图2。312020年版第二次征采建议稿反应值y）对数剂量（x）图2：四参数逻辑斯蒂（

38、logistic）曲线模型四参数逻辑斯蒂（logistic）曲线方程为：A-D?=D+?B（35）1+（C另一种等价的方程形式为：?=D+A-D（36）1+?B(?-logC)上述式中y为反应值或反应值的特定函数；为标准品或供试品的各剂量；x为对数剂量，x=logd；A为d0时的y（S形：下渐进线；反S形：上渐进线）；D为d时的y（S形：上渐进线；反S形：下渐进线）；A+DC为?=时对应的d，即50%有效浓度（EC50或ED50）；2B为斜率因子(与EC或ED50处曲线斜率相关)。50公式中对数的底数可取任一适用的底数，常以无理数e或10为底。A、B、C、D即为拟合曲线的4个特色性参数。本法主

39、要以基于细胞的生物学活性测定法为例论述四参数回归计算法的实验设计及运算过程。实验设计实验设计中要求S和T的剂量组数（n）应相等，每个剂量组反应值的个数m）也应相等，且每个重复数应为独立重复。每组剂量间隔一般呈连续的等比稀释，也可采用非连续的独立稀释。实验过程中，应防范使用有严重地址效应的细胞孔，如会产生边沿效应的外周孔，S和T加样地址应尽量依据随机、均衡摆列的原则，也可采用随机区组设计，以减少实验偏差。异常值办理获取并记录试验数据后，需采用必定的策略鉴别和办理异常值，应检查产生异常值的原由。关于技术性或物理性等明确原由以致的异常值可直接剔除，如细322020年版第二次征采建议稿胞孔污染、加样错

40、误等；而对没有查明原由的异常值原则上不该剔除，即使剔除也要采用适合的统计学方法，而且剔除比率应极低。关于异常值剔除的统计学方法及其缺项补足，见本公则“三、量反应平行线测定法”中异常值剔除项。四参数逻辑斯蒂（logistic）模型拟合一般采用适合的计算机软件中四参数逻辑斯蒂（logistic）自由模型和拘束模型，依据非线性最小二乘法的原则，进行S和T剂量反应曲线的自由拟合和拘束拟合，分别获取S和T自由拟合及拘束拟合曲线中A、B、C、D四个参数的预计值。拘束模型为一平行曲线模型，此中S与T拟合方程的A、B、D三个参数的预计值分别相同，仅参数C的预计值不一样。方差分析按（37）（39）式将拘束模型总

41、变异进行分解，采用适合的计算机软件计算各项变异的差方和、自由度（f），按（18）式计算各变异项方差。差方和总=差方和试品间+差方和回归+差方和残差（37）差方和残差=差方和残差+差方和偏离平行（38）差方和残差=差方和模型失拟+差方和偏差（39）上述式中差方和残差代表标准品和供试品拘束模型的残差平方和差方和残差代表标准品和供试品自由模型的残差平方和靠谱性测试经过对剂间变异的分析，以测试S和T的对数剂量和反应的关系能否明显偏离平行曲线。剂间变异分析为试品间、回归、偏离平行和模型失拟四项：残差的方差用以进行试品间、回归和偏离平行三项变异的F测试，偏差项的方差用以进行模型失拟的F测试。由适合的计算机

42、软件计算获取各变异项的P值。当P0.05或P0.01，即以为在此检验水平下该项变异有明显意义。靠谱性测试结果判断靠谱性测试结果，回归项应特别明显（P0.01）；偏离平行和模型失拟均应不明显（P0.05）。个别状况下，当残差或偏差项的方差特别小时，偏离平行或模型失拟检验结果可能判为明显，建议此时以残差或偏差质控图中平常均匀水平代替该次试验水平进行计算。试品间一项不作为靠谱性测试的判断标准。试品间变异特别明显者，重复试验时，应参照所得结果重新预计T的效价或重新调整剂量再进行试验。满足上述条件，即可以为实验结果的靠谱性成立。相对效价预计及置信区间的计算关于靠谱性成立的实验结果，方可按等反应剂量比的原

43、则，采用拘束模型中S和T拟合曲线EC50的比值，计算供试品的相对效价（R）。R=标准品EC50100%供试品EC50（40）再按下式计算供试品的效价（PT）332020年版第二次征采建议稿PT=AT?R采用经考据的适合计算机软件进行单次相对效价计算R的置信区间的计算，R置信区间的高限和低限分别乘以AT得PT置信区间的高限和低限。关于多次实验结果的合并计算见本公则“实验结果的合并计算”部分。在进行本法运算时，选择的计算机软件应能获取与本法实例一致的计算结果。对符合S形量反应模型的供试品进行效价计算时，假如没有适合的计算机软件或统计专家的帮助，没法使用四参数回归计算法的状况下，也可选择剂量反应曲线

44、中呈近似直线关系的一段剂量范围，将反应值进行适合变换，按“三、量反应平行线测定法”预计效价。实例例6四参数回归计算法重组人粒细胞刺激因子（GCSF）生物学活性测定NFS-60细胞/MTT比色法测定方法见重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法（公则3525），试验中S和T（标示量AT：2.4107IU/300g）用基础培育液稀释至每1ml含200400IU，而后做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，酶标仪吸光度测定结果见表6-1。以yi,j,k表示S或T每一剂量水平的反应值，此中i表示S或T办理组，i=0时为S办理组，i=1时为T办理组；j表示第j个剂量组；k表示每一剂量水平的第k个重复

45、数。6-1GCSF生物学活性（NFS-60细胞/MTT比色法）测定结果终浓度标准品S供试品Ti,j,k）（IU/ml）反应值1（yi,j,k）反应值（i,j,k）反应值（i,j,k）反应值（2y1y2y2001.4201.3701.4251.4151001.4081.3381.3951.364501.2021.1851.2201.197250.8400.8430.8630.86212.50.5620.5600.5770.5576.250.4230.3910.4130.4043.1250.3350.3330.3450.3431.56250.3120.3020.3170.313（1）四参数逻辑斯蒂

46、（logistic）模型拟合采用适合的计算机软件中四参数逻辑斯蒂（logistic）自由模型对表6-1测定结果中的数据进行S和T剂量反应曲线的拟合，其决定系数R2分别为0.997和0.999，S和T自由模型拟合曲线中A、B、C、D四个参数的预计值见表6-2。表6-2S和T自由模型拟合曲线中各参数的预计值ABCDS0.3131.83425.661.439T0.3191.83425.511.456以yi,j（fm）表示自由模型每一剂量水平的拟合值，则：342020年版第二次征采建议稿S自由模型拟合方程：y?i,j(fm)0.3131.4391.439xi,j,k1()1.83425.66T自由模型

47、拟合方程：y?i,j(fm)0.3191.4561.456xi,j,k)1.8341(25.51再采用适合的计算机软件中四参数logistic拘束模型对表6-1测定结果中的数据进行S和T剂量反应曲线的拟合，S和T拘束模型拟合曲线中A、B、C、D四个参数的预计值见表6-3。表6-3S和T拘束模型拟合曲线中各参数的预计值ABCDS0.3161.83326.081.448T0.3161.83325.111.448以yi,j（cm）表示拘束模型每一剂量水平的的拟合值，则：S拘束模型拟合方程：?0.3161.448yi,j(cm)1.448xi,j,k)1.8331(26.08T拘束模型拟合方程：?0.

48、3161.448yi,j(cm)1.448xi,j,k)1.8331(25.11（2）方差分析试验数据列表依据表6-1计算S和T办理组所有反应值的均匀值y、S或T办理组所有反应值的均匀值yi、S或T第j个剂量组内反应值的均匀值yi,j和每一剂量组反应值的相对标准偏差RSD；按上述拟合方程分别计算自由模型中ST每个剂量水平的拟合值yi,j（fm）；拘束模型中S和T每个剂量水平的拟合值yi,j(cm)；将结果列入表6-4。表6-4S和T试验数据列表（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）xi,j,kyi,j,kyRSDyi,jyi,j（fm）yi,j（cm）iy2001.4201.3701

49、.3952.51.4141.4220.8020.807S1001.4081.3381.3733.61.3531.359501.2021.1851.1941.01.1831.185352020年版第二次征采建议稿250.8400.8430.8420.30.8630.86012.50.5620.5600.5610.30.5510.5496.250.4230.3910.4075.60.3920.3933.1250.3350.3330.3340.40.3360.3391.56250.3120.3020.3072.30.3200.3222001.4251.4151.4200.51.4311.4230.8

50、131001.3951.3641.3801.61.3701.365501.2201.1971.2091.31.2001.198250.8630.8620.8630.10.8770.880T0.5770.5570.5672.50.5610.56312.56.250.4130.4040.4091.60.3990.3983.1250.3450.3430.3440.40.3430.3401.56250.3170.3130.3150.90.3260.323将总变异进行分解，计算各项变异的差方和和自由度（f）。（1）总变异差方和总=(1.420-0.807)2+?+(0.302-0.807)2+(1.42

51、5-0.807)2+?+(0.313-0.807)2=6.10858?=282-1=31总（2）试品间变异差方和试品间=28(0.802-0.807)2+(0.813-0.807)2=0.00108?试品间=2-1=1（3）回归项变异差方和回归=(1.422-0.802)2+?+(0.322-0.802)2+(1.423-0.813)2+?+(0.323-0.813)22=6.09729?回归=5-2=3（4）偏离平行项变异差方和偏离平行=(1.420-1.422)2+?+(0.302-0.322)2+(1.425-1.423)2+?+(0.313-0.323)2-(1.420-1.414)2

52、+?+(0.302-0.320)2+(1.425-1.431)2+?(0.313-0.326)2=4.468E04?偏离平行=8-5=3（5）残差变异362020年版第二次征采建议稿差方和残差=(1.420-1.414)2+?+(0.302-0.320)2+(1.425-1.431)2+?+(0.313-0.326)2=0.01052?残差=282-8=24失拟项变异差方和模型失拟=2(1.420-1.414)2+?+(0.307-0.320)2+(1.425-1.431)2+?+(0.315-0.326)2=0.00505?模型失拟=28-8=8标准品失拟项变异：差方和标准品模型失拟=2(1

53、.420-1.414)2+?+(0.307-0.320)2=0.00360?标准品模型失拟=8-8/2=4供试品失拟项变异：差方和供试品模型失拟=2(1.425-1.431)2+?+(0.315-0.326)2=0.00145?=8-8/2=4供试品模型失拟偏差项变异差方和偏差=0.010517-5.056E03=0.00546?=282-28=16偏差（3）靠谱性测试按本公则“三、量反应平行线测定法”中（18）式计算各变异项方差，将方差分析结果列表进行F测试，见表6-5。表6-5方差分析及F测试结果变异的本源自由度差方和方差FP试品间10.001080.001082.467420.12932

54、（0.05）回归36.097292.032434638.55572.732E-33（0.01）偏离平行34.468E-041.489E-040.339890.79666（0.05）残差240.010524.382E-04模型失拟80.005056.319E-041.851250.14013（0.05）标准品40.003609.000E-042.636980.07273（0.05）供试品40.001453.637E-041.065530.40557（0.05）偏差160.005463.413E-04总变异316.108580.19705注：表中残差为残差靠谱性测试结果判断依据历史数据设定S和T拟

55、合曲线R2应0.98，每一372020年版第二次征采建议稿剂量组反应值的RSD应10%。靠谱性测试结果判断以下：（1）S和T拟合曲线的R2分别为0.997和0.999，均符合规定。（2）S和T每一剂量组内反应值的RSD均10%，均符合规定。（3）回归项特别明显；偏离平行和失拟检验项均不明显。结论：实验结果成立。（4）相对效价（PT）及置信区间计算相对效价R按拘束模型中S和T拟合曲线EC50（见表6-3中C值）的比值计算相对效R。26.08R=100%=103.9%25.11再按下式计算供试品效价：2.4107PT=AT?R=30010-3103.9%=8.3107（IU/mg）采用适合的计算机

56、软件，按渐进置信区间法计算本次相对效价R的置信区间98.3%109.7%，PT的置信区间为（7.98.8）107IU/mg，R和PT的相对置信区间均为94.6%105.6%预计效价的94.5%105.5%。382020年版第二次征采建议稿五、质反应的生物实验数据分析某些没法定量丈量的检验，每个试验单位只有二分的丈量结果，比方观察到动物的存活或死亡，细胞的响应超出或未超出预设的限度等。办理该类检验适用于质反应测定法。质反应测定法与量反应测定法的差异在于，在每个剂量下的n次独立重复丈量仅获取一个单一的值，即响应比率。将对数剂量对响应比率作图，平常将获取型的剂量响应曲线。该曲线平常可以经过积累正态分

57、布函数表示。使用积累正态分布函数的模型平常称为概率单位（probit）模型，使用逻辑斯蒂分布函数的模型平常称为logit模型，二者计算结果不存在有意义的差异，均可接受。常用Bliss迭代法计算模型参数。1.概率单位(Probit)变换的平行线法（1）将实验数据输入工作表I，按工作表I和工作表II的循环迭代第一将试验数据输入工作表I以下数字表记的各列。标准品或供试品的剂量该剂量下的单位数m该剂量下产生阳性响应的单位数r对数剂量x每组阳性响应的比率p=r/m。从列(6)开始，循环迭代计算结果：第一个循环时，列Y所有填写0积累标准正态分布方程对应的值=(Y)工作表I的列（8）到列（10）用以下公式计

58、算：（41）（42）（10）mZ2（43）2工作表I的列（11）到（15）的wx，wy，wx2，wy2和wxy可以由该表的列（4），9）和（10）算得，对每供试品和标准品分别计算列（10）到（15）各列之和（）。表十三质反应模型的工作表I模板(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)剂量mrxpYZywwxwywx2wy2wxyS.=392020年版第二次征采建议稿T.=将工作表I计算获取的乞降转移至工作表II中的列（1）到（6），经过以下公式计算工作表II列（7）到（12）：（44）（45）(46)（47）（48）表十四质反应模型的

59、工作表II模板(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)wwxwywx2wy2wxySxxSxySyyxyaS.T.=供试品和参照标准品的共同斜率参数b由以下公式算得：（49）供试品和参照标准品的截距参数a由以下公式算得，并填入工作表II的列（12）：（50）用yabx公式计算并代替工作表I中的列（6），开始重复循环，直到两个循环计算出的Y值差异足够小后停止（比方，两个连续循环中算得的Y值差异小10-8）。（2）靠谱性测试经过对变异的分析，以测试S和T的对数剂量和反应的关系能否明显偏离线性和平行性。S和T需最少涵盖3个剂量，偏离线性的程度可以经过以下方法丈量

60、。在工作表II中增添第13列，由公式51计算：402020年版第二次征采建议稿（51）22，对工作表II第13列的计算结果乞降获取值，以自由度f=K2h查表（K=dhd为每个测试品的浓度数；h为总的测试品数目，只有一个标准品和一个供试品，则h=2），可获取尾区概率P。当P0.05或P0.01，即为在此概率水平下对线性的偏离线性有明显意义。偏离平行性的程度可以经过以下方法丈量。工作表II中的数据经过公式5222计算获取值，以自由度f=h-1查表，可获取尾区概率P。当P0.05或P0.05）。明显偏离线性应当复试。实验者在剂量设置时应该尽可能保证S和T的对数剂量均覆盖各自S型曲线多数反应量的双侧，