卡托普利对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞ATP敏感钾通道含量的影响

1、卡托普利对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞ATP敏感钾通道含量的影响【摘要】目的观察卡托普利晚期预适应对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞ATP敏感钾通道含量的影响。方法建立培养乳鼠心室肌细胞缺氧/复氧损伤模型。设正常对照组、缺氧复氧组、缺氧预适应组和卡托普利预适应组。利用激光共聚焦显微镜观察ATP敏感钾通道含量的变化。结果培养的心室肌细胞的Kir6.1及Kir6.2通道蛋白主要在胞浆表达。Kir6.1的含量在缺血再灌注后有所增加，晚期预适应及卡托普利预适应组的Kir6.1的含量大于缺血再灌注组，但Kir6.2的含量在各组均无显著性差异。结论卡托普利晚期预适应作用的发挥与ATP敏感钾通道的蛋白表达增加有关。【关键词

2、】卡托普利；缺氧复氧；ATP敏感钾通道；激光共聚焦显微镜；心室肌细胞研究显示血管紧张素转化酶抑制剂AEi在防治再灌注性心律失常1，心肌顿抑和心肌坏死2等方面显示了较好的治疗效果，AEI预适应的心脏保护作用愈来愈受到重视。ATP敏感钾通道被认为是缺血预适应信号级联反响中的重要效应因子,实验证实ATP敏感钾通道的开放在心脏保护中具有重要作用3。本实验利用激光共聚焦显微镜研究了在卡托普利晚期缺血预处理过程中ATP敏感钾通道含量的变化，旨在讨论AEI的晚期缺血预处理作用的离子通道机制。1材料与方法1.1材料IT2倒置显微镜LYPUS日本，二氧化碳培养箱(RAK日本)。胎牛血清和含各种氨基酸和葡萄糖的D

3、E合成培养基(Gib公司)。激光扫描共聚焦显微镜(LS,美国eridian公司)。一抗：兔抗鼠钾通道蛋白Kir6.1及Kir6.2多克隆抗体USA，BD公司；二抗：荧光标记羊抗兔抗体IgG/FIT美国Santaruz公司。1.2方法1.2.1新生大鼠心肌细胞的原代培养4，5取新生14distar大鼠(吉林大学医学部实验动物部提供)，仰卧固定，75%酒精消毒皮肤，开胸摘取心脏。于预冷无钙镁磷酸缓冲液PBS的平皿中，剪取心室肌组织成13碎块，放入三角烧杯中，用0.1%胰蛋白酶分次消化，轻吹打，静置2in，自然沉淀，弃上清。沉淀再次消化反复2次后取上清；移入无菌离心管中，参加4预冷含小牛血清的DE终

4、止胰酶作用，轻吹、混匀后，1000r/in10in、4离心、弃上清，反复3次，以洗去残存胰酶；以差速贴壁法纯化心肌细胞，使纯度到达90%以上。以1.5106/l接种于预先用50g/L多聚赖氨酸涂布过的2.52培养瓶，在37、95%2+5%2的二氧化碳孵箱内进展培养。每2日更换一次培养基，取培养4日的单层细胞进展实验。在培养瓶中参加无菌的盖玻片，制备心肌细胞爬片。1.2.2爬片鉴定采用肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色法，显示心肌细胞纯度达90%以上。1.2.3心肌细胞缺氧、复氧及模拟缺血模型的制备6参照Kyaa等的方法。培养的心肌细胞生长接近交融状态时，弃去培养液，参加缺氧液并向培养瓶中冲入100

5、%氮气，以置换培养瓶中的空气，用胶塞密闭瓶口，即缺血缺氧模型。复氧时，将缺氧液倒掉，参加复氧液并开放培养瓶瓶口，即为复氧模型。1.2.4实验分组1.2.5爬片制备固定：用多聚甲醛固定20in；漂洗：以0.01l/LPBSpH7.4振洗3in，共洗3次；以0.3%过氧化氢室温处理30in，封闭内源性过氧化物酶的活性；PBS漂洗2in，共2次；3%正常灭活羊血清室温孵育30in，以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色；轻轻弃去孵育液，不冲洗，滴加第一抗体130稀释，37湿盒内孵育1h，4冰箱过夜；PBS充分冲洗5in，共3次，以除去非特异性吸附的抗体；滴加带荧光标记的二抗150稀释，湿盒内孵

6、育30in，PBS振洗3in，共3次。1.2.6LS观察1.3统计学处理数据以xs表示，两组间比拟采用t检验。转贴于论文联盟.ll.2结果LS将免疫荧光显示技术和带电脑激光扫描共聚焦显微细胞仪的检测技术结合起来，可较准确地定量细胞中蛋白质的变化，被检测物质的多少是以其检测物质被荧光标记的平均荧光值来表示。Kir6.1及Kir6.2通道蛋白主要在胞浆表达。培养的心室肌细胞的Kir6.1的含量在缺血再灌注后有所增加，晚期预适应及卡托普利预适应组的Kir6.1的含量大于缺血再灌注组，但Kir6.2的含量在各组均无显著性差异。见表1，图1。表1各组荧光强度的比拟(略)3讨论在缺血再灌注损伤及预适应的研

7、究中对ATP敏感钾通道的讨论大多局限在其功能状态方面，而对其分子程度的变化研究甚少。本实验利用LS研究了在卡托普利晚期缺血预处理过程中ATP敏感钾通道含量的变化。参与组成ATP敏感钾通道的Kir为内向整流ATP通道，家族成员包括Kir6.1、Kir6.27，8。ATP敏感钾通道不仅分布于细胞膜，还广泛分布于细胞内膜性细胞器的膜上9。本实验也证实了这一点，Kir6.1、Kir6.2的表达均定位在细胞浆。实验结果显示：培养的心室肌细胞的Kir6.1的含量在缺血再灌注后有所增加，晚期预适应及卡托普利预适应组的Kir6.1的含量大于缺血再灌注组，但Kir6.2的含量在各组均无显著性差异。restanell10曾报道缺血再灌注损伤时心肌Kir6.1的RNA及蛋白质程度上调。假如给予血管紧张素II的I型受体拮抗剂或AEi进展预处理，Kir6.1的RNA及蛋白质上调程度就会受到抑制。本实验结果与文献报道的不符，可能与所用的AEI种类不同和选择的时间点不同有关，但这方面的报道相对很少。另有报道11示对培养的心肌细胞或在体心脏经过Urrtin促肾上腺皮质激素