检验中心培训课件2 肖艳群-分子检测实验室设置、人员及质量管理体系建立要求-上海市临床检验中心

1、分子检测实验室设置、人员及质量管理体系建立要求上海市临床检验中心肖艳群医疗机构临床实验室管理办法 卫医发200673号医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法卫办医政发2010194号医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法总则第二条 临床基因扩增检验实验室是指通过扩增检测特定的DNA或RNA，进行疾病诊断、治疗监测和预后判定等的实验室，医疗机构应当集中设置，统一管理。第三条 本办法适用于开展临床基因扩增检验技术的医疗机构。第五条 以科研为目的的基因扩增检验项目不得向临床出具检验报告，不得向患者收取任何费用。第二章 实验室审核和设置医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法第三章 实验室质量管理第十四

2、条 医疗机构临床基因扩增检验实验室人员应当经省级以上卫生行政部门指定机构技术培训合格后，方可从事临床基因扩增检验工作。第十五条 医疗机构临床基因扩增检验实验室应当开展实验室室内质量控制，参加卫生部临床检验中心或指定机构组织的实验室室间质量评价。室间质量评价结果及时通报医疗机构和相应省级卫生行政部门。医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法第四章 实验室监督管理第十八条 省级以上卫生行政部门指定机构对室间质量评价不合格的医疗机构临床基因扩增检验实验室提出警告。对于连续2次或者3次中有2次发现临床基因扩增检验结果不合格的医疗机构临床基因扩增检验实验室，省级卫生行政部门应当责令其暂停有关临床 基因扩增

3、检验项目，限期整改。整改结束后，经指定机构组织的再次技术审核合格后，方可重新开展临床基因扩增检验项目。医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法第二十条 医疗机构临床基因扩增检验实验室出现以下情形之一的，由省级卫生行政部门责令其停止开展临床基因扩增检验项目，并予以公告：（一） 开展的临床基因扩增检验项目超出省级卫生行政部门核定范围的（二） 使用未经国家食品药品监督管理局批准的临床检验试剂开展临床基因扩增检验的（三） 在临床基因扩增检验中未开展实验室室内质量控制的（四） 在临床基因扩增检验中未参加实验室室间质量评价的（五） 在临床基因扩增检验中弄虚作假的（六） 以科研为目的的基因扩增检验项目向患者收

4、取费用的（七） 使用未经培训合格的专业技术人员从事临床基因扩增检验的（八） 严重违反国家实验室生物安全有关规定或不具备实验室生物安全保障条件的国家相关技术指南测序技术的个体化医学检测应用指南（试行）遗传性相关个体化医学检测应用指南（试行）肿瘤个体化治疗检测应用指南（试行）孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范实验室建设硬件 实验室设置 实验室设备软件 人员资质、能力 质量管理体系建立 质量管理体系实施实验室信息管理系统实验室设置普通PCR实验室设置原则上分为四个区：试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区如使用全自动扩增分析仪，后两区可合并如使用核酸提取、扩增和产物分析一体化的全自动

5、分析系统，后三区可合并具体实验室分区应根据其所使用的技术平台及检验项目和工作量而定NGS实验室设置原则：工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时普通PCR实验室产物分析区缓冲区扩增区标本制备区缓冲区试剂准备区缓冲区缓冲区工作流向注意事项：各区有独立的缓冲区各区都有水池各区有独立的通风系统（建议有窗户的房间为PCR实验室）标本制备区有冲眼器和生物安全柜产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）测序区缓冲区文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区缓冲区缓冲区缓冲区工作流向标本与文库制备区：血浆分离、DNA提取、末段修复与纯化、加“A”与纯化、接头连接与纯化文库扩增与检测区：PCR扩增与纯化、文库

6、浓度检测、pooling 、pooling后文库定量测序区：测序前准备（乳液PCR及磁珠富集）、测序上机、信息分析、报告审核及发放植入前胚胎遗传学诊断（全基因组低拷贝测序）电泳区缓冲区测序区缓冲区文库检测区缓冲区扩增一区缓冲区WGA制备区 试剂准备区缓冲区工作流向缓冲区WGA制备区：全基因组扩增电泳区：DNA检测及结果反馈、DNA打断扩增一区：末端修复及纯化、加“A”与纯化、接头连接与纯化、pooling 、缺口平移文库检测：测序区：扩增前准备（乳液PCR及磁珠富集）、测序仪上机数据分析、报告发放遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）电泳区缓冲区测序区文库检测区

7、文库扩增区杂交铺获区 DNA打断区标本与文库制备区试剂准备区（扩增二区） （扩增一区）缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区缓冲区标本与文库制备区：DNA提取及检测、纯化测OD、末端修复与纯化、加“A”与纯化、Adapter连接与纯化杂交捕获区：Pre-Captured-PCR与纯化 、OD值检测及pooling、杂交、洗脱与纯化文库扩增与检测区：Post-Captured-PCR与纯化、Pooling及文库定量检测测序区：测序前准备（C-Bot制备)、测序仪上机数据分析、结果解读、Sanger验证、报告发放Sanger测序验证标本与文库制备区：DNA提取与检测、目的片段PCR反应准备扩增一区：

8、目的片段扩增与纯化、测序PCR前准备电泳区：电泳扩增二区：测序PCR扩增与纯化测序仪上机、结果分析与解读、报告发放NGS实验室设计注意事项电泳区：DNA提取、DNA纯化后大小检定等步骤需用电泳，单独成区，但不同的检测项目可共用测序区：应根据使用仪器要求设定温、湿度分区设置可根据自动化仪器设备做适当区间整合无创产前筛查实验室，因血浆提取为胎儿微量DNA，为防止污染，不能与其他项目的标本制备区共用其他：实验室通风、生物安全柜等要求参照普通PCR实验室空间要求实验室空间足以保证：标本处置符合分析前、后样本分区放置、仪器放置符合维修和操作要求、打印检验报告时交叉污染的控制标本接收区建议放在四个区域以外

9、的房间开展基于组织的分子病理项目宜有独立的切片制备和前处理（脱蜡、水化）区域 。脱蜡、水化应在通风设施中进行。有防止切片时造成标本污染措施（有独立的前处理区、不同患者标本更换新的刀片）工作区域要求实验室各分区应配置固定和移动紫外线灯，波长为 254nm，照射时离实验台的高度一般为 6090cm样品制备区应配置二级生物安全柜和洗眼器，实验室附近应有喷淋装置储存设施要求用以保存临床样品和试剂的设施应设置目标温度和允许范围，并记录。实验室应有温度失控时的处理措施并记录实验室环境各工作区域应有明确的标记进入和使用实验室各区域应有明确的限制和措施，防止患者和其他非相关人员的随意进出实验室应根据所用仪器和

10、检测过程对环境温、湿度的要求，规定实验室温、湿度允许范围，有效实施监控，并有记录实验室工作要求进入各工作区域应按照单一方向进行不同工作区域内的设备、物品不得混用不同的工作区域宜使用不同的工作服，工作人员离开各工作区域时不得将工作服带出工作结束后，必须立即对工作区进行消毒。可使用可移动紫外灯在工作完成后调至实验台上6090cm内照射实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区标本制备区扩增区扩增产物分析区的方向进行有消毒和清洁相关的记录实验室工作要求实验室所有操作应符合实验室生物安全通用要求标本处理需在生物安全柜内进行，对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内开盖所有经过检测的反应管不得在扩增区打开

11、凝胶电泳、杂交、测序等应在产物分析区进行，应注意此区扩增产物的污染实验室应严格管理实验标本，医疗废弃物应按医疗废弃物管理条例进行管理实验室信息系统建立信息系统管理制度，制订计算机（办公用除外）和计算机网络使用权限、登陆密码、维护的规定，有计算机安全保密和病毒防范的要求，并定期备份计算机数据，保证信息安全和完整。包括标本接收、报告发放流程定期评估检验项目、检验结果输入、输出一致性人员资质实验室负责人：至少具有中级专业技术职称、医学检验或相关专业背景。有从事分子诊断工作的经历实验室操作人员：具备相关资质并经过有资质的培训机构培训合格取得上岗证后方可上岗签发分子病理报告的医师：至少具有中级病理学专业

12、技术职务任职资格，并有从事分子病理工作的经历签发分子遗传报告的医师：至少具有中级遗传学专业技术职务任职资格，并有从事分子遗传工作的经历NGS实验室人员要求NGS检测实验室管理和技术人员：专业、学术水平、教育培训情况需符合要求NGS实验室技术人员：需有PCR上岗证，且应接受NGS技术的理论与实验培训，经考核合格后方可上岗NGS数据分析人员：应参与NGS数据分析培训，并考核合格后方可上岗；或有NGS技术服务行业从事数据分析工作经验（有详细记录或证明资料）岗位描述实验室应至少具有 2 名本单位在职检验/检查人员。开展遗传性疾病或基于组织、细胞等分子病理并出具诊断报告的实验室，应至少具有1名具备出具相

13、关诊断报告资质的医师。人员管理应建立分子诊断技术人员相关的教育背景、专业资格、培训、经历及能力记录档案，并定期更新，内容包括：a)证书或执照复印件b)教育或以前的工作资料c)职务说明d)继续教育记录e)能力评估等质量管理体系质量管理体系如何建立？文件和记录如何管理？质量管理体系建立作用质量手册建立并保持质量管理体系有效运行的重要基础规范各项工作，保证工作质量程序文件操作规程内容：质量手册、程序文件、操作规程、记录依据：基于标准文件、实验室实验工作经验积累记录质量体系建立1.组织和人员管理方面的文件，应包括实验室各类人员的岗位职责、岗位培训、继续教育以及定期考核2.环境、设施及安全管理3.仪器、

14、设备的采购、验收、使用、维修、校准4.检验试剂及其他相关消耗品的采购、验收、保管、领用及使用5.样品的采集、运送、接收、处理及保存6.检验方法的选择、确认或验证7.检验项目及仪器设备标准操作程序的建立和管理8.检验结果质量保证Why：目的Where：范围Who：职责What：做什么When：何时做How：如何做9.检验报告管理的规定。10.记录的管理文件或程序11.对差错事故及不符合工作的纠正及预防措施12.对服务对象投诉处理注意：适合自身实际情况，可操作性现行有效做、写、记一致操作规程项目：（1）项目名称、检验方法名称；（2）方法学原理；（3）试剂品牌、代号、包装规格、内含物；（4）仪器品牌

15、、型号；（5）具体操作步骤（包括主要的仪器测定参数）；（6）质控品使用方法、使用水平和频率、质控规则；（7）操作性能概要，如精密度、正确度、线性范围、可报告范围、灵敏度、特异性、方法的局限性（如干扰物质等）、操作注意事项；（8）参考值或参考范围；（9）临床意义；（10）病人准备、标本要求；（11）参考文献；（12）编写者和日期；（13）科主任对每个项目操作规程的签字认可，确定生效日期。仪器设备：使用、维护保养、校准等内容NGS项目SOP编写要求实验室必须为每一个NGS检测项目建立齐全和规范的SOPSOP源于一些标准文件和实验室实验工作经验的积累SOP应包括试剂准备（试剂来源及配制）、样品采集、

16、样品接收与预处理、核酸提取、测序方法和参数、测序仪器操作、生物信息学算法/软件包和流程、结果分析和报告、实验室安全措施等NGS项目SOP编写要求描述检测项目分析靶区域（例如，多基因组合、外显子组、全基因组、染色体非整倍性等）描述检测项目可以适用的样品类型（例如外周血、血浆、FFPE石蜡标本），并指明本项目建立和验证过程中所采用的样品类型核酸提取和文库构建的方法和试剂靶区域（例如多基因组合、外显子组）捕获的方法和试剂湿实验分析过程的对照与设置方法测序平台、测序反应的试剂或耗材的版本（例如反应池/flow cells、芯片）测序设备上用于产生原始数据及输出格式（如fastq文件）的软件和版本号监控

17、和评估测序过程的指标和质量控制参数分析流程的接受和拒绝标准（例如，如果测序覆盖度不能达到特定检测项目的最低要求，采用NGS进行靶向区域测序的结果就可能存在假阳性或假阴性，从而与后续的Sanger测序验证结果不符，因此就需要对于这类项目建立可以接受的靶向区域覆盖度标准 ）NGS生物信息分析SOP编写要求详细描述NGS数据的整个生物信息分析流程输入文件、输出文件及每步分析内容每部过程中的质控条件及参数(read的质控、碱基质量、测序深度、覆盖度)数据筛选的流程及依据记录管理原始记录和质量记录应完整、清晰，电子记录应定期备份。实验室所有质量管理记录均应按相关规定保存（如分子病理、遗传病、NIPT等）

18、注：质量管理记录，应包括但不限于标本接收、标本储存、标本处理、仪器和试剂及耗材使用情况、校准、室内质控、室间质评、检验结果、报告发放等内容无仪器打印结果的检验项目应有原始记录，记录信息至少应包括检测日期、方法、试剂品牌、批号、有效期、检验结果、检验者注：凝胶图像和斑点杂交原始记录可通过扫描、拍照等方式保留所有检测的原始记录和导出数据均应包括足够的信息以保证其能够再现标本检测过程中，应及时、准确、如实记录，包括操作人员、仪器、试剂及原始数据、计算和/或导出数据、质控信息等分子遗传、分子病理、产前筛查与诊断等相关记录的保存期限按相关要求执行实验记录（NGS）实验条件、步骤、计算软件试剂、引物、测序反应、平台检测的目标区域