激活素A刺激肾小管上皮细胞转分化的研究

1、激活素A刺激肾小管上皮细胞转分化的研究【摘要】目的研究激活素a对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法取人肾小管上皮细胞株进展体外培养，分别向培养液中参加激活素a或激活素a+卵泡抑素，应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子蛋白(tgf-)的表达，以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果与对照组和卵泡抑素组相比，激活素组肾小管上皮细胞表达的tgf-蛋白显著增多。结论激活素a能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化，提示激活素a可能在肾小管间质纤维化中起重要作用。【关键词】激活素a;卵泡抑素;肾小管上皮细胞;转化生长因子蛋白abstratbjetivetstudythestiulatingeffetf

2、ativinanthetransdifferentiatinfrenaltubuleepithelialellsulturedinvitr.ethdsrenaltubuleepithelialellstrainsereulturedinvitr;ativinarativinaplusfllistatinereaddedinttheultureslutinandiunhisheialethdasappliedindetetingtheexpressinftransfringgrthfatr(tgf-)prteinintheulturedellsandthetransdifferentiatinf

3、renaltubuleepithelialellsasbserved.resultthetgf-prteinexpressedbyrenaltubuleepithelialellsinativinagrupinreaseduhrethanthatinntrlgruprinfllistatingrup.nlusinsativinaanprtetheprliferatinandtransdifferentiatinfrenaltubuleells,hihsuggeststhatativinaayplayaniprtantrleininterstitialfibrsisfrenaltubule.ke

4、yrdsativinafllistatinrenaltubuleepithelialellstgf-prtein激活素a(ativin，at)是由性腺分泌的肽类激素，是近年来发现的重要细胞因子，具有广泛的生物学活性1。at分泌病理性地增高或降低，可以导致组织细胞分化、增生、代谢异常2-3。卵泡抑素(fllistatin,fs)也是由性腺分泌的糖蛋白激素,可阻断at的生物学效应。at和fs形成体内一对天然的拮抗体，共同调节组织细胞的分化，同样，其在肾脏细胞的分化中也具有显著调控作用。故本实验观察at对人肾小管上皮细胞增殖、转分化的影响，讨论at在肾小管纤维化中的作用，为说明肾组织纤维化的发病机制

5、，讨论防治方法提供新的实验根据。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞人近端肾小管上皮细胞株(hk2，购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所)。1.1.2主要试剂de/f12培养基(df，hylne公司)，重组人激活素a(at-a)、卵泡抑素(fs)，(美国peprteh公司)，胎牛血清(fs，gib公司)，胰蛋白酶(gib公司)，小鼠抗转化生长因子蛋白单抗工作液(tgf-)、sp免疫组化试剂盒、dab显色试剂盒(北京中杉生物技术公司)。1.2方法1.2.1细胞培养及传代取hk2细胞株，参加含15%fs的df培养基，吹打后以105/l的细胞含量接种于细胞培养瓶中，37、5%2条件下培养，3

6、天后换液。倒置显微镜观察，待细胞交融生长为单层后，0.25%胰蛋白酶与0.02%edta1:1混合后消化、1：2传代，传至35代取细胞行各指标检测。1.2.2细胞增殖检测消化指数生长期hk2细胞，调细胞密度为1104/l,接种于96孔平底培养板上,37、5%2条件下培养48h，无血清fd培养液洗涤2次，参加不含血清、但含不同浓度(0.3100ng/l)的at培养液(a组)，换入不含血清、但含不同浓度(0.3100ng/l)的fs培养液(f组)，30ng/lat+不同浓度(0.3100ng/l)fs培养液(a+f组)，含无血清培养基的空白对照组(组)再培养48h。空白对照组和每一浓度组都重复4孔

7、。分别于培养完毕前4h参加tt(5g/l)20l/，第48h完毕培养。弃上清，参加ds150l/孔，振荡10in。在酶标光度计上测光吸收值,测定波长为490n，所得光吸收值代表相应孔细胞的相对数量。1.2.3免疫组化检测tgf-将指数生长期细胞消化后以1104/l/孔接种到24孔培养板中，37、5%2条件下培养24h，无血清fd培养液洗涤2次，换入不含血清、但含不同浓度(0.3100ng/l)的at培养液(a组)，换入不含血清、但含不同浓度(0.3100ng/l)的fs培养液(f组)，30ng/lat+不同浓度(0.3100ng/l)fs培养液(a+f组)，含无血清培养基的空白对照组(组)，再

8、培养48h。空白对照组和每一浓度组都重复4孔。取片，冲洗，固定，冲洗，双氧水和羊血清封闭，tgf-单抗，pbs代替一抗作为阴性对照，4过夜，冲洗3次，再参加二抗，37水浴1小时，进展dab法染色，以细胞浆出现棕黄色并高出背景，胞核呈浅蓝色的为阳性染色，采用leia-qin图象分析系统测定每张片上的阳性单位灰度值，灰度值越高说明目的物质表达越少。1.3统计学处理数据应用spss10.0统计软件进展分析，p0.05为有显著性差异。2结果2.1at-a对肾小管上皮细胞生长的影响at-a对肾小管上皮细胞生长有明显的促进作用，在30ng/l以内，呈剂量依赖性，当其浓度达100ng/l时，促进小管上皮细胞

9、增生的作用反而减弱(p0.01);单独给fs对肾小管上皮细胞增生无明显影响(p0.05);但fs能拮抗at对肾小管上皮细胞生长的促进作用，也呈剂量依赖性(p0.01)见表1。表1不同浓度at和fs对肾小管上皮细胞生长的影响注：*与0ng/l比拟，p0.01;#与at组比拟，p0.012.2免疫组化结果免疫组化染色片采用图像分析阳性染色灰度值结果显示：at显著促进肾小管上皮细胞表达tgf-，并呈剂量依赖关系(p0.01);fs对肾小管上皮细胞分泌tgf-无明显影响(p0.05);但fs能拮抗at促进肾小管上皮细胞分泌tgf-的作用，也呈剂量依赖性(p0.01)，见表2。表2免疫组化tgf-图像分

10、析光密度值注：*与0ng/l比拟，p0.01;#与at组比拟，p0.013讨论肾小管上皮细胞转分化是肾小管间质纤维化形成的重要原因，而tgf-被公认为致纤维化的重要因子，是小管上皮细胞转分化为成纤维细胞的标志蛋白。at是新发现的tgf-超家族成员，研究证明正常成人肾脏中几乎没有at的表达，但其天然拮抗物fs的表达却非常丰富，在急性缺血再灌注损伤的肾组织中at的表达显著上调，而fs表达明显下降4。这些资料提示，at可能在肾组织纤维化的发生开展机制中也起有重要作用。本实验向体外培养的人肾小管上皮细胞培养液中参加外源性的at，结果发现at在(0.3-100)ng/l范围内呈剂量依赖性地刺激肾小管上皮

11、细胞增殖，说明at对小管上皮细胞的刺激增生作用有一定的适应浓度范围。我们的试验还发现，at以剂量依赖方式促进肾小管上皮细胞分泌tgf-，tgf-的表达，是小管上皮细胞转分化为成纤维细胞的标志，说明at能刺激肾小管上皮细胞转分化，而肾小管上皮细胞转分化为成纤维细胞是其大量分泌细胞外基质，导致肾组织纤维化的始动环节。因此，研究结果说明at在肾组织纤维化的发生开展中起重要作用。已经明确fs能与at不可逆地高亲和力结合，从而阻断at的作用。本实验利用fs能中和at的特性，向小管上皮细胞培养体系中参加fs，结果说明，单纯参加fs，对肾小管上皮细胞的增殖及其表达tgf-无明显影响，但与at同时存在时，能显著抑制at对小管上皮细胞刺激增殖和表达tgf-的作用，说明fs能抑制at介导的肾小管上皮细胞转分化，可能有防治肾组织纤维化的潜能。【参考文献】1assaguej.hellsreadtgf-signalsj.natrevlellbil.2000,1(3):169178.2assaguej,blains，lrs.tgf-signalingingrthntrl,aner,andheritabledisrdersj.ell.2000,103(2)：295309.3henyg,lui,h,lin,sl，etal.regulatinfellprliferatin,apptsis,anda