临床微生物学

1、1 临床微生物学基础复旦大学附属华山医院抗生素研究所徐 晓 刚2感染性疾病的危害性根据世界卫生组织的统计数据感染性疾病导致死亡原因中居第二位在致残病因中居第一位全球每年死于结核病者达300万(约14人/分钟）世界人口的1/3曾感染结核中国为结核病高发区，居第二位中国人中45曾感染结核3 抗菌药物、病原微生物及 机体相互作用关系抗菌药物机体 病原微生物耐药性药效学(PD )毒性药动学(PK)感 染防 御4细菌的发现荷兰人列文虎克（Antoni van Leeuwenhoek）用自己制造的显微镜观察到了被他称为“小动物”的微生物世界 5感染和感染性疾病十九世纪德国Koch在固体培养基上分离出第一个

2、纯培养的细菌-碳疽芽孢杆菌通过动物实验，提出了确定病原微生物的“郭霍法则（Koch postulate ）” 动物感染部位能分离到特定微生物健康动物体内分离不到这一微生物这一微生物接种于健康动物可致病被感染动物能再分离到这一微生物6感染和感染性疾病金黄色葡萄球菌引起的疖结核分枝杆菌引起的淋巴结核1882-1894年期间分离出许多重要的致病菌，被称为细菌学发展的“黄金时代”7感染性疾病与病原微生物?鸭子天鹅部分感染临床表现不典型89金葡菌青霉素耐药金葡菌革兰阳性菌耐药性的进化甲氧西林耐药金葡菌 (MRSA)甲氧西林1970s青霉素1950s万古霉素万古霉素耐药肠球菌(VRE)1997万古霉素中度

3、耐药金葡菌(VISA) 2002 万古霉素耐药金葡菌(VRSA)金葡菌获得了vanA最后防线 195510嗜麦芽窄食单胞菌出现抗菌药物嗜麦芽窄食单胞菌（1310株）耐药敏感左氧氟沙星12.185.0复方磺胺甲噁唑11.786.6米诺环素2.096.311“中国”对“万古霉素耐药”并无免疫力12临床标本分离到泛耐药菌株不一定预后差有的感染部位药物浓度高有的感染具有自限性有的分离株为寄植，而非感染病原有研究显示，部分耐药株毒力低于敏感株与感染部位及基础疾病密切相关中枢感染及血流感染预后差13主要内容基本概念及常见病原微生物日常诊疗工作相关基础研究14感染和感染性疾病临床常见的病原微生物临床标本的采

4、集和检测一、基本概念及常见病原微生物15感染和感染性疾病感染(infection)：病原体突破宿主的抵御功能，侵入体内，与机体相互作用、相互斗争的过程.感染性疾病(infectious diseases)：导致机体产生临床症状、体征或生理功能异常.16感染和感染性疾病根据机体的免疫状态及侵入机体的病原微生物的毒力、数量等不同可出现以下结局： 病原清除隐性感染显性感染潜伏性感染病原携带显性感染病原清除隐性感染潜伏性感染病原携带17致病菌和外源性感染 致病微生物(pathogen)： 一般健康人体不携带，能引起人类疾病的微生物称为致病微生物或病原微生物,细菌、真菌则称为致病菌. 如:炭疽杆菌、结核

5、分支杆菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌，甲、乙、丙、丁肝炎病毒等外源性感染（exogenous infection）：指由外界的致病微生物进入正常人的人体组织，与宿主相互作用、相互斗争的过程；引起宿主组织损伤和功能障碍者则称为感染性疾病. 如：炭疽病、结核病、脑膜炎、白喉、细菌性痢疾、病毒性肝炎等18常见病原微生物病原微生物分类细菌bacterium (pl. bacteria)需氧菌 aerobe厌氧菌 anaerobe病毒virus真菌fungus (pl. fungi)其他 others支原体、衣原体 Mycoplasma, Chlamydia立克次体

6、Rickettsieae螺旋体 spirochetes19临床主要病原菌球菌 cocci：革兰阳性球菌Gram-positive cocci革兰阴性球菌Gram-negative cocci杆菌bacilli：革兰阴性杆菌Gram-negative bacilli革兰阳性杆菌Gram-positive bacilli20革兰阳性球菌 Gram-positive coccci葡萄球菌属 Staphylococcus spp.：金黄色葡萄球菌(金葡菌) Staphylococcus aureus表皮葡萄球菌(表葡菌) S. epidermidis腐生葡萄球菌 (腐葡菌) S. saprophyti

7、cus链球菌属 Streptococcus spp.化脓性链球菌 Streptococcus pyogenes肺炎链球菌 S. pneumoniae草绿色链球菌 S. viridans肠球菌属 Enterococcus spp.:粪肠球菌 E. faecalis屎肠球菌 E. faecium21革兰阳性菌所致的感染性疾病葡萄球菌属：皮肤软组织感染skin and soft tissue infections(SSTI)败血症septicemia,心内膜炎endocarditis呼吸道感染respiratory tract infections(RTI)尿道感染urinary tract inf

8、ections (UTI)链球菌属：咽炎pharyngitis、扁桃体炎tonsillitis、肺炎pneumoniae细菌性心内膜炎bacterial endocarditis脑膜炎meningitis肠球菌属：尿路感染UTI腹腔感染abdominal infections胆道感染biliary tract infection细菌性心内膜炎bacterial endocarditis22革兰阴性杆菌Gram-negative bacilli肠杆菌科 Enterobacteriaceae埃希菌属：大肠埃希菌 Escherichia coli克雷伯菌属：肺炎克雷伯菌Klebsiella pneu

9、moniae肠杆菌属：阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、 产气肠杆菌E. aerogenes沙雷菌属：粘质沙雷菌Serratia marcescens变形杆菌属：奇异变形杆菌Proteus mirabilis摩根菌属：摩根摩根菌Morganella morganii枸橼酸杆菌属：弗劳地枸橼酸杆菌Citrobacter freundii沙门菌属：沙寒沙门菌Salmonella typhi志贺菌属：福氏志贺菌属Shigella flexneri23革兰阴性杆菌Gram-negative bacilli非发酵菌 Nonfermenters假单胞菌属：铜绿假单胞菌P. aerugin

10、osa不动杆菌属：鲍曼不动杆菌A. baumanni窄食单胞菌：嗜麦芽窄食单胞菌S. maltophilia产碱杆菌：粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis黄杆菌属：脑膜败血黄杆菌F. meningosepticum24革兰阴性杆菌Gram-negative bacilli其他others:嗜血杆菌属：流感嗜血杆菌H. influenzae鲍特菌属：百日咳鲍特菌Bordetella pertussis军团菌属：嗜肺军团菌Legionella pneumophilia螺杆菌属：幽门螺杆菌Helicobacter pylori弯曲菌属：空肠弯曲菌Campylobacter jejuni

11、25革兰阴性杆菌引起的感染革兰阴性杆菌可引起几乎所有脏器的感染血流感染中枢神经系统感染泌尿生殖系统感染肺部感染腹腔感染26正常菌群 在正常人体体表与外界相通的腔道：口腔、鼻咽腔、肠道、泌尿生殖道存在的多种微生物.在机体免疫功能正常时对人体有益无害，因以细菌和真菌为主，故称“正常菌群”在正常情况下，宿主、正常菌群和外界环境相互适应，保持平衡状态正常菌群的存在是保持人体健康的重要因素生物拮抗免疫形成产生维生素等2728内源性感染（endogenous infection）当机体抵抗力降低时，原来正常寄居或致病力很低的微生物可能侵入人体其他易感部位造成的感染，又称自身感染或机会感染条件致病菌（opp

12、ortunistic pathogen）环境中通常不致病的细菌人类正常菌群异位人类正常菌群失调条件致病菌和内源性感染29二重感染（suprainfection）临床上较长期、大量使用广谱抗菌药物杀灭了大量正常菌群耐药的致病和低度致病的病原体大量繁殖生长破坏了原有平衡，形成菌群失调，严重时称菌群失调症或菌群交替症，即二重感染30 苛 养 菌肺炎链球菌嗜血流感杆菌是一类生长需要特殊营养物质的细菌，与许多感染性疾病有关，其分离培养较为困难31苛 养 菌营养要求高 肺炎链球菌 培养基内要加入血或血清 流感嗜血杆菌 X、V因子比较脆弱 对干燥、对寒冷的抵抗力低培养条件 510CO2、35培养 24 48

13、h呼吸道其他快生长细菌的覆盖使分离率非常低32临床标本的采集和检测标本类型呼吸道标本 深部咳出痰 支气管灌洗液 咽拭子 鼻气管吸出液 尿液 血液 脑脊液伤口、脓液其它体液 胸水 心包液 引流液 腹水 滑囊液33标本的采集抗菌药物使用前正确的部位正确的时间足够的数量无菌的容器特殊要求应在化验单上注明34标本的处理涂片光镜检查分离培养和鉴定免疫学检查动物接种35涂片光镜检查各种标本均应制成涂片，行革兰染色或特殊染色（抗酸或墨汁染色），直接形态学检查诊断很多感染性疾病病原的最基本和快速的方法痰涂片和革兰染色白细胞（WBC）25/LPF鳞状上皮细胞（SEC）10/LPF合格痰标本必须具备的条件，如不符

14、合上述指标，检验科有责任通知临床重新采样Konemans Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 2006. 6th ed.37尿液检查未离心的尿液镜检10 WBC/mm3尿沉渣镜检5WBC/HPF清洁中段尿培养和菌落计数： 104-105菌落/ 毫升病原微生物生化反应鉴定微量化根据纯分细菌的形态、菌落特征，特征性的生化反应，选择合适的API鉴定系统:肠杆菌科细菌：API 20E非发酵革兰阴性杆菌：API 20NE葡萄球菌属：Slidex Staph Plus API Staph链球菌属：Slidex Strepto Kit A

15、PI Strep奈瑟菌属、嗜血杆菌属：API NH厌氧菌：API 20A38菌种鉴定鉴定到种首先须涂片镜检临床的要求尿中的抗酸杆菌流感嗜血杆菌杆菌，副流感嗜血杆菌科研的要求谷氨酸棒状杆菌G+变多杀巴斯德菌G-流感嗜血杆菌杆菌与副流感嗜血杆菌39菌种鉴定鉴定到种简称：药敏试验 测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长能力的试验,称细菌对药物的敏感性试验，亦称抗菌药物对细菌的抑菌试验。40抗感染药物的敏感性试验供临床医师选用抗菌药物时的参考细菌耐药性监测和耐药性变迁评价新抗菌药物的药效学特征对细菌耐药谱分析和分型有助于某些菌种的鉴定作为医院内感染流行病学调查的手段之一41药敏试验的目的稀释法试管稀释法

16、（肉汤稀释法）平板稀释法（琼脂稀释法）扩散法（纸片法）Kirby-baure(K-B)法E-Test联合药敏42药物敏感性试验测定的方法43若干常用指标MIC(最低抑菌浓度 minimal inhibitory concentration)在体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度 MBC(最低杀菌浓度 minimal bactericidal concentration)在体外能够使细菌总数减少(杀灭)99.9%以上的最低药物浓度。MIC50、MIC90在一批实验中能抑制50%或90%受试菌所需的MIC。 MBC50 MBC90在一批实验中能使50%或90%受试菌的活菌数减少99.9%所需的MBC

17、。临界浓度（breakpoint）根据抗菌药物抑制细菌生长所需要的MIC，结合常用剂量时该药所能达到的血药浓度，划定细菌对各种抗菌药物敏感或耐药的界限。 S 敏感 I 中介 R 耐药 临床意义？44如何阅读药敏试验报告常规用药时达到平均血浓度，一般相当于或略高于对细菌的MIC当细菌引起的感染，仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌药物浓缩部位，如尿液，胆汁等才被抑制，称细菌对该药呈中度敏感。45中介 I药物对某一细菌的MIC高于药物在血或体液中可能达到的浓度有时细菌能产生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，仍应判定该菌为耐药46耐药 RMRSAPNSPVRE 和HLARE

18、 ESBLAmpC47临床重要耐药细菌的实验室检测和临床意义苯唑西林：1ug/片金葡菌 11-12mm凝固酶阴性葡萄球菌 17mm4%NaCl- 6ug/ml苯唑西林盐平板培养条件：35，24-48小时结果：1个菌落生长，判定为甲氧西林耐药（MR）菌株头孢西丁：30ug/片金葡菌 19mm凝固酶阴性葡萄球菌 24mm分子生物学方法:PCR扩增mecA基因48耐甲氧西林葡萄球菌的检测临床意义-lactamasesmecA抗菌药物MSSA(甲氧西林敏感金葡菌)/除青霉素外大多敏感MRSA(甲氧西林耐药金葡菌)大多耐药（万古霉素除外）49万古霉素纸片扩散法含量：30ug/片结果：透射光，抑菌圈内出现

19、薄雾状或任何其他生长或抑菌圈14mm均表示耐药抑菌圈15-16mm为中度敏感，MIC抑菌圈17mm判定为敏感万古霉素耐药确证试验含6ug/ml万古霉素的MH平板1-10ul 0.5 5MacFarland Standard菌悬液35 ，24小时，1个菌落生长即判定为耐药 分子生物学方法:VanA、VanB、VanC 等基因50耐万古霉素肠球菌检测临床意义耐药表型特性VAN AVAN-R、TEC-R VAN BVAN-R、TEC-SVAN CVAN-I、TEC-SVRE菌株耐万古霉素肠球菌可测试对氯霉素、红霉素及利福平的敏感性51上海地区以vanM型为主上海地区多家医院开始出现此型万古霉素耐药耐药肠球菌多数菌株表现为多重耐药，仅对少数新上市药物敏感53二、日常诊疗工作相关基础研究动物及其他体外模型研究分子生物学研究生物信息学研究快速诊断技术54 动物实验与感染