核糖体DNA ITS序列分析在药用植物研究中的应用

1、核糖体DNA ITS序列分析在药用植物研究中的应用 赵欢吴卫郑有良潘红梅翟娟园【摘要】药用植物核rDNA是高度重复的串联序列，由于同步进化的力量，大多数物种中这些重复单位间已发生纯合或接近纯合。5.8SrDNA把核rDNA的内转录间隔区分为ITS1和ITS2两部分。由于ITS序列变异较快，可以提供较丰富的变异位点和信息位点，已在药用植物鉴别、道地性研究、栽培与野生药用植物遗传差异分析、较低分类阶元的系统发育和分类研究中发挥重要作用。【关键词】核糖体DNAITS区药用植物Keyrds：NulearrDNA;ITSsequene;ediinalplants人们对药用植物的研究有着悠久的历史。随着植

2、物遗传学规律的发现与应用，植物大量次生代谢产物的别离与结果鉴定及其对系统学意义的讨论，进一步加深了人们对药用植物的认识。现代分子生物学技术的迅速开展，使以形态组织学、解剖学等客观指标为划分根据的传统分类学得到了补充，为药用植物系统与进化研究提供了丰富而翔实的资料，为解决分类学、系统发育、物种形成与进化等方面的难题提供了极为有力的技术途径1。中药用于疾病防治已有几千年的历史，但由于中药现代品质监控技术缺乏，常常出现药材混淆代用、成心伪制的现象，严重影响中药的声誉，甚至危及人身平安，建立健全完善的中药品质检测技术体系迫在眉睫。目前，越来越多的研究者将ITS应用于药用植物的鉴别，为提醒药用植物的遗传

3、差异和鉴定中药材品种的道地性提供了新的方法和手段2。本文着重对核糖体DNAITS序列分析在药用植物的鉴定、道地性研究、栽培与野生药用植物遗传差异分析及药用植物科以下等级系统与进化研究中的应用进展了综述。118S-26SrRNA基因的根本构造目前，核基因组序列在药用植物鉴定和品质研究中的应用主要集中在编码核糖体RNA基因nrDNA重复区内。高等植物细胞核中nrDNA是高等植物中的rRNA基因(rDNA)是高度重复的串联序列单位，18S，5.8S和26SrDNA联结在一起，作为一个转录单位。18S-26SrDNA在植物中有一至数个位点3，拷贝数可达50040000，18S-26SrDNA根本构造由

4、18SrDNA，26SrDNA，5.8SrDNA和位于三者之间的基因内转录间隔区(ITS)组成，其中ITS区由被5.8SrDNA所分隔的ITS1和ITS2两个片段组成4。其转录物(transript)不参加成熟核糖体，只是部分地对nrDNA的成熟起作用。目前，国内外学者已利用nrDNA中的ITS片段序列作为分子标记，在药用植物鉴定和品质研究方面开展了许多有益的工作。l8S-26S核rDNAITS区在核基因组中高度重复，而且通过不等交换和基因转换，这些重复单位间已经发生了位点内和位点间的同步进化，即不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致，且所受选择压力较小，碱基交换速率较快，进化速度快，加上片

5、段长度变异很小，ITS1和ITS2的长度均缺乏300bp，在绝大多数被子植物中缺乏700bp，非常适宜进展各种分子操作5。屈良鸽等通过对不同生物类群的ITS序列(自生物学数据库)的比较得出：被子植物大多数科属其ITS序列的种间差异值为1.210.2，属间差异值为9.628.8，这对系统发育研究来说都是较适宜的范围。另外，ITS在一些起源古老或世代较长的植物类群(如木本竹子)中的变异较低，也为研究那些间隔区进化速度很慢的古老类群间的关系和长世代类群内较高阶元的系统重建提供了可能性6。2ITS区测序的技术流程及系统学分析目前研究者对ITS序列分析的详细流程大体一样，主要包括总DNA提娶PR扩增、克

6、隆、测序、排序等步骤。2.1总DNA的提取采用TAB法或在此根底上略加改良，从新颖叶片、鲜茎、甚至保存数年的蜡叶标本中提取总DNA。在野外，可先用硅胶枯燥法保存材料，然后带回实验室提取总DNA。所提取DNA的纯度是影响测序准确性的关键因素。2.2PR扩增、产物纯化及测序选择适宜的引物对ITS区进展扩增，然后经琼脂糖电泳检测、回收、纯化。对PR产物进展纯化是直接测序的关键，可用离心透析法、透析袋法等。也可先对PR产物进展克隆，然后测一个或者多个序列。Baldin7曾指出，在被子植物系统发育分析中，是测定ITS区PR克隆，还是直接测定PR全部产物的序列更好，尚处于争论之中。常用的测序仪有：PE公司

7、的ABI3l0，ABI377自动测序仪、LKBDNA测序仪等。2.3排序用手工或计算机软件如LUSTALV、LUSTALX、LUSTAL、DNASTAR程序等对所测得的序列进展排序，然后根据空位(gap)情况对排序结果进展适当调整。ITS1和ITS2的范围可根据GeneBank上已发表的植物18S、5.8S和26SrDNA序列以及近缘类群的ITS1、ITS2序列确定。2.4系统学分析对已排好的序列进展变异位点(variablesite)和信息位点(infrativesite)数目的统计，然后进展系统学分析，只有信息位点才能用于系统学分支分析。常用的分析软件有PAUP分析软件、PHYIIP3软件

8、包、EGA等。对转换(transitin)和颠换(transversin)进展加权和对于将gap作为缺失(issing)或新性状(nestate)得到的简约树树形大致一样，但自展数值(btstrap)不同。最常用的分支分析法有简约法(parsinyethd)、邻接法(nEighbr-jiningdistaneethd)、最大似然法(axiulikelihdethd)等。3rDNAITS序列分析在药用植物鉴定中的应用资源调查说明，我国中草药约有1.2万余种，其中药用植物约占85，对它们进展明确的鉴别是非常重要的。中药材的准确鉴定是中药研究和实现中药现代化的基矗由于我国药用植物种类繁多，药材来源复

9、杂，在药材使用上存在互混、互代、以假充真等及同名异物、同物异名现象，因此影响了用药的平安性和有效性。应用形态学、组织学和化学成分来鉴定比较困难，通过比较分析ITS区序列，可以很容易地鉴别其真伪8。中药南五味子为华中五味子的枯燥果实。绿叶五味子的化学成分与南五味子有所不同，但果实外形相似，使市场上南五味子药材真伪难辨。高建平等9通过比较采自湖南、四川、陕西、河南、山西、浙江等的12个自然居群的华中五味子和绿叶五味子rDNAITS区的DNA序列的差异及其规律性，得出rDNAITS区为鉴别中药南五味子与混淆品绿叶五味子的一种良好的分子标记。柴胡是一种多来源药材，在我国的使用已有两千多年的历史。柴胡具

10、有和解表里、疏散退热、疏肝解郁、升阳举气之成效。用于治疗感冒发热、口苦耳聋、头痛目眩等症。目前，在中国报道的柴胡属植物有42种，17变种，7变型。谢晖等10和武莹等11的研究均发现：ITS序列可以作为柴胡类药材鉴定的根据。此外，en等12对人参属12种植物的ITS区和5.8SrDNA进展了序列分析和有效鉴别，发现西洋参与东亚种人参、竹节参、三七具有更近的亲缘关系。Ngan等13以保守的植物序列作引物，对ITS区进展了扩增，并籍以鉴定人参属6种药用植物。蒋继宏等14研究苏皖产大戟属内6种药用植物的ITS区，其结果与来自形态学的研究结果相吻合，从而得出ITS区可用于大戟属植物种间及真伪品鉴别。郝明

11、干等15通过ITS的序列比较，将白花蛇舌草与外形上与其相似的纤花耳草、伞房花耳草和松叶耳草区别开来。刘忠权等16搜集目前市场上出现的白花蛇舌草及伪品共9种，通过对其ITS2区的序列的分析，将白花蛇舌草及伪品区分开来。金成庸等17为研究韩茵陈和白莲蒿是否为同一植物，同时对来源于两个不同国家的3种茵陈韩茵陈、白莲蒿和茵陈蒿的rDNAITS序列进展遗传差异的讨论，认为用rDNA的ITS序列分析法鉴别茵陈类药材，方法简便、准确。彭雪梅等18通过对罗布麻及其易混品的DNA分子鉴定，可以将罗布麻同其混淆品大白叶麻和A.annabinu区分开来。丁平等19比较巴戟天与常见混伪品之间的rDNAITS区碱基序列

12、的差异及其规律，得出ITS序列可作为巴戟天与混伪品的一种较好的分子指纹图谱的标记方法。4rDNAITS序列分析在药用植物科以下等级系统与进化研究中的应用价值ITS区序列分析已成为在分子程度上讨论科、亚科、族内关系非常有效的手段，在植物系统发育与分类的研究中起了重要作用。4.1科内系统与进化刘艳玲等20基于核糖体DNAITS区序列讨论了睡莲科植物7属11种的系统发育的关系，结果说明，莲属Nelub可从睡莲科中独立出来成立莲科Nelubnaeae和莲目Nelubnales；萍蓬草属仍应置于睡莲科中；水盾草属abba和莼菜属Brasenia聚成一小支并构成姐妹群，说明这两属之间亲缘关系较近；睡莲属和

13、芡实属Euryale、王莲属Vitria聚成一小支并构成姐妹群，说明三者亲缘关系较近，仍应置于睡莲科中。此外，nrDNAITS序列分析用于槭树科、菖蒲科、柽柳科、金缕梅亚科、君子科风车子亚科、金缕梅科壳菜果亚科等科的系统发育研究中获得了很好的结果。4.2属内系统与进化关系亲密的物种间ITS长度接近，而序列有一定程度的变异，因此，该片段特别适宜于属，尤其是近缘属间关系等低级分类群的研究21。Kita和It22利用ITS序列对产于东亚的乌头亚属一些二倍体种与四倍体种进展了系统发育分析。Utelli等23为理解释产于欧洲的黄花牛扁A.1ytnu复合体的系统关系，测定了产于欧洲与高加索山脉的所有牛扁亚

14、属的种与产于欧洲的乌头亚属的种的nrDNAITS序列及pDNA的psbA-tH序列，并运用简约性方法，进展了系统发育分析。张富民等24对乌头属AnituL.27个类群的nrDNAITS序列进展了简约法与邻接法分析，结果说明，紫乌头A.delavayi复合体不是一个单系类群，可能经历了3次不同的起源。这三项研究显示，ITS序列数据均为乌头属植物系统发育关系研究提供了有意义的信息。赵国平等25测定中日当归属21份材料药用植物的ITS区序列，经Phylip软件分析，建立系统发育树，聚类结果与当归属药用植物成效差异根本吻合。汪红等26研究中药丹参ITS片段遗传多样性，发现该序列在丹参种内保守，在属间有

15、较大的差异，与外类群的差异最大。蒋继宏等27研究苏皖产大戟属内6种药用植物的ITS长度的变异，聚类所得系统进化树与形态学的研究结果相吻合，为讨论大戟属植物的系统演化关系和大戟属植物鉴定提供DNA分子证据。闫坤等28对地黄属6个物种进展了核糖体内转录间隔区ITS序列分析，结合形态学研究认为，地黄属为单系起源，天目地黄与湖北地黄有较近的亲缘关系；高地黄和裂叶地黄应为同一物种；地黄与茄叶地黄是属内进化程度最高的类群。4.3种内系统与进化由于nrDNA的ITS区域具较多的碱基变异信息，在长度上具较好的保守性，因此近十几年来被广泛地用于生药的种间鉴别29。曹晖等30还认为可将ITS区用于种下一级分类群亲

16、缘关系研究。罗玉明等31分析紫苏属各变种间(紫苏、白苏、鸡冠苏和耳齿紫苏等)rDNAITS区的序列以及存在的单核苷酸多态性(SNP)现象，设计出位点特异性PR引物，用于紫苏属各变种间的分子标记鉴别。吴玲等32利用ITS序列对石蒜属13个种(含变种)的亲缘关系进展分析，说明石蒜属13个种可分为三大类，比较系统进化树和核型分析，推导出稻草石蒜、乳白石蒜和短蕊石蒜为变种。5应用rDNAITS序列讨论药用植物道地性中药的品质关系到临床用药的平安有效，开展道地药材是实现中药现代化的关键。药材道地性主要是指药材中有效成分的地域差异性，品质优良是道地药材的表现型。药材道地性研究是药学研究的热点之一，主要包括

17、两个方面：一是研究形成药材道地性的重要原因；二是如何鉴别药材市场上的道地性药材。药用植物道地性的形成与其代谢过程中的酶系统发生的“道地性变化有亲密联络，但这种变化受其居群的遗传特性和生态环境的影响。目前，关于药用植物品质的研究多限于形态、化学药效学方面，但道地性药材与非道地性药材在形态和生药性状等特征上的差异常不明显，这给应用传统方法鉴别道地药材带来了困难33。DNA分子作为遗传信息的载体，不受材料的生长环境及发育时期等的影响，通过rDNAITS序列分析，找到不同样本间在DNA程度上的遗传差异，对药材地理分布和分化变异进展评判与划分，不仅使从分子程度上来提醒药材道地性形成的原因成为可能，而且使

18、道地药材的鉴定更为便利、准确。假设同时结合药效成分分析，对于道地药材的品质评价能起到指导性作用34。为研究莲的种质资源道地性的鉴定、为其质量控制和莲的GAP施行提供科学根据，林珊等35和唐先华等36分别从分子程度上比较了不同地区莲的差异，结果说明不同地区莲的ITS区序列有一定的差异，莲样品的ITS区序列即其ITS及5.8SrDNA的序列分析资料可为莲的品种鉴别及分类提供新的手段。半夏为天南星科半夏属植物，其枯燥块茎为我国传统大宗药材。张君毅等37对来自我国半夏主要的16个居群18个样本rDNA中的ITS区序列进展分析，得出半夏rDNA变异与其地理分布相关。马玉花等38对l5个来自不同地区杜仲品系rDNA的ITS序列分析，为分布于我国同地区杜仲的分类鉴别提供分子生物学根据。王淑美等39讨论不同产地牛膝的ITS的序列变异，得出牛膝与川牛膝及土牛膝碱基序列有明显差异，不同产地、不同栽培品种牛膝碱基序列无差异。目前，应用DNA序列分析方法讨论药用植物道地性的研究虽然才刚起步，但是将来自不同居群药材的化学成分和其DNA序列分析相结合那么可以为药用植物道地性的研究提供更多的信息。6rDNAITS序列分析在研究野生与栽培药用植物遗传差异上的应用由于生态环境的改变等因素，生物的遗传特性及其生药品质在一定程度上发生了变化，产地和栽培对生药品