冰冻切片实验步骤

1、全部实验步骤1取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时230%蔗糖脱水48小时以上-25oC包埋（冰冻切片机内）冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片4um左右，室温25C复温30min，浸入4C预冷的丙酮固定lOmin,PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）用30%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配,避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。PBS（PH为7.2-7.4,酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，

2、距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。5%BSA,室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。甩去血清，PBS洗1min,擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100）,悬空加入一抗工作液50-100ul,枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。放入湿盒内，置于4C冰箱过夜（最长不可超过48h）,注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现

3、背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。第二天上午取出玻片，置常温复温30min,后PBS冲洗1+5+5+5min,滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h,后PBS冲洗1+5+5+5min。滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h,后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。DAB显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，

4、此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间2s-10min,显色时间过长背景高，且可靠性低）终止DAB显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止5min,后在显微镜下观察是否有DAB颗粒附着。甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为6-10s,可不用酒精分化，直接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）个3min,滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜封片后干燥1h（或者在通风橱吹风的情况下15min）,用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。观察照相。针对脱片问题，我做了如下处理。但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过单涂胶：往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul,用另一张玻片推片，然后叠加其上，停留5分钟，中间推动玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片，滤纸吸干玻片下缘，置玻