叶绿体的分离与荧光观察实验报告

1、姓名：徐静 科目：细胞实验山东大学实验报告班级：10级生命基地学号：201000140121题目：叶绿体的分离与荧光观察同组者：张姗田娜王安琪.实验目的1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。实验原理叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中 进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生 物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心 即可分离集中进行各种研究。叶肉细胞中的叶绿体内含叶绿素，使植物呈现绿色。叶绿体是细胞内扁 平的椭球形或球形的三

2、个双层膜细胞器之一，叶绿体内基粒是光合作用的场 所。高等植物（如葫芦藓）的叶绿体呈椭球状，在不同的光照条件下，叶绿体 可以运动，改变椭球体的方向，这样既能接受较多的光照，又不至于被强光灼 伤。在弱光下，叶绿体以其椭球体的正面朝向光源；在强光下，叶绿体以其椭 球体的侧面朝向光源。因此，在不同光照条件下采集的葫芦藓，观察到其小叶 内叶绿体的形状不完全一样。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方 法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离 心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大 小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力

3、和离心时间，就能够使非均一 悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获 得各种亚细胞组分。沉降顺序为：细胞核一线粒体 *溶酶体与过氧化 氢酶体 *内质网与高尔基体 *核蛋白体。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35 mol / L氯化钠或0.4 mol / L蔗糖溶液） 中进行.以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r/min的条 件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后， 在3000 r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。 分离过程最好在05C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。荧光

4、显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发 态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见 光），这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物 质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的 火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧 光染料后同样也能发出荧光.这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体 吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影 响，如温度、光、淬灭剂等。

5、因此在荧光观察时应抓紧时间.有必要时立即拍 照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。实验仪器1、器材：（1）主要设备：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。（2）小型器材：烧杯，量筒，滴管，刻度离心管，纱布， 无荧光载片和盖片2、材料：新鲜菠菜。3、试剂：0.35 mol / L 氯化钠溶液，0.01%吖啶橙（acridine orange）。实验方法选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦十后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml 0.35mol / L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。利用组织捣碎机低速（5 000 r / min）匀浆35min。将匀浆用6层纱布过滤于50

6、0ml烧杯中。取滤液4ml在1000 r / min下离心2 min。弃去沉淀。将上清液在3000 r / min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。将沉淀用0.35 mol / L NaCl溶液悬浮。取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下 观察：在普通光镜下观察；在荧光显微镜下观察；取叶绿体悬液 一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0. 01 %吖啶橙荧光染料，加无荧光 盖片后即可在荧光显微镜下观察。实验结果1、实验结果记录普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部 含有较深的绿色小颗粒，即基粒。以Olympus荧光显微镜

7、为例，在选用B（blue）激发滤片、B双色镜和0ss。（orange）阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光（图三）。加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光（图四），而其中混有的细胞 核则发绿色荧光。2、实验结果图图一普通显微镜中菠菜叶的叶绿体（10 x40）图二 普通显微镜中菠菜叶的叶绿体（10 x40）图三 荧光显微镜菠菜叶绿体（未染色）（10 x40） 图四荧光显微镜中菠菜叶绿体（染色）（10 x40）实验分析差速离心时要控制号速度和时间，否则会影响最后的叶绿体的观察，甚至可能无法分离出叶绿体；差速离心只能得到80%纯度的叶绿体，要想获得更纯的叶绿体，可以用密度 梯度离心法；差速离心分