e6-5细菌转化实验和噬菌体实验

1、e6-5细菌转化实验和噬菌体实验1928年FrederickGriffith的肺炎双球菌(Streptococcuspneumoni转化(transformation)实验是DNA作为遗传物质的第一个有利证据。他所使用的肺炎双球菌有两种，一种为光滑型(smooth，S),其细胞壁的外面有一个多糖荚膜(capsule)，另一种为没有荚膜的粗糙型(rough，R)。S型双球菌感染小鼠会导致小鼠患败血症而死亡，但将S型双球菌加热杀死后再感染小鼠则不会致病。R型肺炎双球菌感染小鼠不会引起小鼠的死亡，但如果将R型细菌和加热杀“死”的S型细菌混合后感染小鼠能导致小鼠死亡，并在其体内检出活的S型细菌图e6-

2、5(1)。Griffith认为，实验的结果是由于加热杀死的S细菌含有某种“转化因子”，可导致活的R细菌发生转化作用，从而使R型细菌恢复了生成荚膜的能力。三年后发现，只需有加热杀死的S细菌的存在，就可导致R型双球菌在体外发生转化。又过了两年，进一步证明只要将S细菌的提取液加到生长着R型细菌的培养基中，同样也能发生转化。那么提取物中究竟是哪一种物质充当“转化因子”促使S细菌发生转化的呢？Griffith最初认为，接种物中的死细菌可能提供了某些特异性的蛋白质为食料，使R型细菌能制造出荚注射(3)注41爼駅分析碍到g壓如貳士总细吧鈕瞬加赢严命图e6-5(1)FrederickGriffith的肺炎双球

3、菌转化实验随后，O.T.Avery、C.M.Macleod和M.Mccarty在前人工作的基础上，经过近十年的努力，终于成功在体外完成了转化实验图e6-5(2)，并确定了这种转化因子的化学本质是DNA，而不是蛋白质或其他的大分子。他们将S型细菌加热杀死后，分离出多糖、脂类、RNA、蛋白质和DNA，然后分别加到R型细菌中培养，仅在加入S型DNA的R型细菌中发生转化，产生了R型细菌和S型细菌。同时他们还用不同的水解酶来处理各提取物，观察对实验的影响，结果发现在DNA中加入一种使DNA降解的DNA酶后就不能发生转化了。但当时人们仍怀疑这一结论，原因有三点:（1）虽然R.Feulgen已证明了DNA是

4、染色体的主要组分之一，但人们仍然认为遗传和染色体上的蛋白质有关。因为蛋白质结构复杂，由20种氨基酸组成，这些氨基酸不同的排列组合将是个天文数字，从而提供更加丰富的遗传信息，且在不同生物体中的同源蛋白之间在结构的特异性上存在着极大的差异。而DNA只含有4种不同的碱基，人们一度认为不同种的生物的核酸只有微小的差异，因而形成一种根深蒂固的观念，即始终相信基因和染色体的活性成分是蛋白质；（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还有其他杂质，可能正是这些少量的特殊蛋白质在起转化作用。当时人们难以忘记，20年前Willstatter由于不能将酶提纯而错误宣称酶不是蛋白质的沉痛教训，这种担心重蹈覆辙的心理

5、也加重了人们对Avery实验结果的怀疑；（3）也有人认为即使转化因子确实是DNA,但DNA可能只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。基于上述原因，Avery的重大发现并未能引起人们的重视，即使到了1949年，Hotchkiss证实了和荚膜无关的细菌性状也能转化，并用实验证明了DNA已提得很纯，其中蛋白质的污染已降至0.02%，这么纯的DNA仍可转化，且纯度越高转化效率也愈高，但这仍未能改变人们的观点，直到1952年，Hershey-Chase的实验才终于让人们彻底信服。法药R剖届甜天活时一$塑曲葩被就耳R轴瞧（誌化j枝輕坏-R轴胞f薪化）吓廻一寻入_尽餐対杞就破坏Ria祀

6、（走特化）翅禹I脂肪_爭人埜細胞理F”心主图e6-5（2）肺炎双球菌的体外转化实验Avery及其同事的体外转化实验尽管设计得十分精确和严密，但很多科学家仍不相信DNA是遗传物质，所幸的是在1955年Avery去世前，即在1952年，A.Hershey和M.Chase所做的实验为其提供了最直接的证据。这一突破性的实验受到了T.F.Anderson两项发现的启发：（1）1949年Anderson发现，将T-偶数噬菌体悬液骤然用蒸馏水稀释，使其受到渗震作用，噬菌体便释放出DNA，留下其中空的头部外壳；（2）噬菌体利用尾部吸附到细菌表面上进行感染，如果用组织搅碎器剧烈搅拌，就可以阻碍感染作用。1951

7、年，Herriott发现这种释放了DNA的噬菌体空壳仍可吸附到细菌上。这些发现为噬菌感染实验奠定了基础。当时已知T2噬菌体是由蛋白质外壳和内部的DNA组成。由于一般蛋白质只含有S而不含P，DNA中含P而不含S,因而Hershey等想到用同位素35S和32p来分别标记T2的蛋白外壳和DNA。他们首先让T2噬菌体，分别去感染在含有32P或35S的培养基中生长的大肠杆菌，在菌体裂解后分别收集裂解菌液，经标记后再分别感染大肠杆菌，感染后培养10分钟，用搅拌器剧烈搅拌，使得吸附在细胞表面上的噬菌体脱落下来，再离心分离，细菌发生沉淀，而游离的噬菌体悬浮在上清液中图e6-5（3）。誉白质外證DNA乩如舸就解，#1噬曲体用堪曲站DNA的噬首体蹙自就奋直4.噬苗体穎技邑裝宿主細更中碍菇，并件埠子我噬曲体年妁増推基中増莽3晦的培泰鼻申培养体空圭中得到图e6-5(3)Hershey-Chase的噬菌体实验经同位素测定，上清液和沉淀中35S的含量分别为80%和20%,这表明蛋白质的外壳脱落下来，并未进入细胞中，沉淀中的20%可能由于少量的噬菌体经搅拌后，仍吸附在细胞上所致。32P则在沉淀中含有70%，而在上清液中仅有30%。这表明噬菌体感染细