微生物基础知识

1、微生物检测相关基础知识及操作1目 录一、微生物基础知识A二、消毒与灭菌B三、无菌技术C四、培养基基础知识D五、微生物限度检查E 一、 微 生 物 基 础 知 识 （一）微生物与微生物学定义 微生物存在于自然界中的一群体型细小、结构简单、肉眼看不见，必须借助于特殊仪器放大后才能观察到的微小生物。 微生物学是研究微生物的形态结构、分类、生理代谢、遗传变异、生态分布和微生物与人类、动植物关系等的一门学科。我们对微生物深入研究的目的在于更好地开发微生物资源，充分利用微生物有利于人类生活方面。控制微生物的有害方面，使之更好地为人类服务。 3一、 微 生 物 基 础 知 识微生物非细胞型微生物原核细胞型微

2、生物真核细胞型微生物病毒亚病毒因子细菌放线菌衣原体 支原体等真菌原生生物4（二）微生物分类一、 微 生 物 基 础 知 识5（三）微生物学分类微生物学检查无菌检查微生物限度检查细菌、真菌（霉菌、酵母菌）控制菌（DY、DC、SM、TL、JP、SJ、BN）其他（内毒素、生物活性） 一、 微 生 物 基 础 知 识（四）微生物的特点个体小,面积大：小于0.1mm。肉眼不可见。分布广,种类多（10万多种）：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等, 土壤中的数量最多。代谢强，转化快：发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自重100010000倍的乳糖。生长旺，繁殖快：微生物有惊人的繁殖速度，大多数微生物几十分钟

3、内就可以繁殖一代。适应性强，易变异：耐药性产生的原因。6一、微 生 物 基 础 知 识铜绿假单孢菌的菌落特征 7一、 微 生 物 基 础 知 识8金黄色葡萄球菌血琼脂平板的菌落特征 菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。一、 微 生 物 基 础 知 识金黄色葡萄球菌Baird-Parker琼脂平板的菌落特征9 菌落呈圆形,表面光滑、凸起、湿 润,直径23mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈 (沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。一、 微 生 物 基 础 知 识 由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌

4、落较大，有的霉菌的菌丝蔓延，没有局限性，其菌落可扩展到整个培养皿，有的菌则有一定的局限性，直径12厘米或更小。菌落质地一般比较疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。 10霉菌菌落特征一、 微 生 物 基 础 知 识 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。 11酵母菌菌落特征（啤酒酵母）一、 微 生 物 基 础 知 识大小：直径形状：圆形、假根形、不规则

5、型隆起形状：扩展、苔状、低凸、凸面、乳头状边缘：整齐、波状、裂叶状、圆锯齿状、有缘毛表面状态：光滑、皱褶、颗粒状、龟裂状、同心环状表面光泽：闪光、不闪光、金属光泽质地：油脂状、膜状、脆透明程度：不透明、半透明 （五）细菌菌落的常规描述12一、 微 生 物 基 础 知 识（六）菌落单位CFU131.菌落形成单位(CFU)指单位体积中的细菌、霉菌、酵母等微生物的群落总数。2.在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，每个菌落就是1CFU。一般直接在显微镜下计算菌体数量会将活与死的菌体全部算入，但是CFU只计算活的菌体数量。3.菌落的个数，

6、传统上叫“个”。但是，一个菌落并不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，因此叫“个”不太准确，准确的叫法是“菌落形成单位”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。一、 微 生 物 基 础 知 识延迟期：少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行 繁殖，生长速度近于零。处于延迟期细菌细胞的特点是分裂迟缓、代谢活跃。对数期：对数期又称指数期。这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。 稳定期：又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物

7、中二者处于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向零。 衰亡期：稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”，此阶段叫衰亡期。 14（七）微生物生长规律一、 微 生 物 基 础 知 识（八）人体中的微生物15皮肤 表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、绿脓杆菌、耻垢杆菌等口腔 链球菌（甲型或乙型）、乳酸杆菌、螺旋体、梭形杆菌、 白色念球菌、（真菌）表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏 球菌、类白喉杆菌胃 正常一般无菌肠道 类杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、厌氧性链球菌、粪链球 菌、 葡萄球菌、白色念球菌、乳酸杆菌、变形杆菌、破 伤风杆菌、产气荚膜杆菌等鼻咽腔 甲

8、型链球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感杆菌、乙型链 球菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等眼结膜 皮表葡萄球菌、结膜干燥杆菌、类白喉杆菌等二、 消 毒 与 灭 菌消毒：杀死物体上病源微生物的方法,并不一定能杀死细菌的芽胞。消毒所用的试剂称为消毒剂。灭菌：杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病原微生物。抑菌：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素，可抑制细菌的繁殖。防腐：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时为消毒剂，低浓度时常为防腐剂。无菌：不存在活的细菌。防止细菌进入人体或其他物品的操作

9、技术，为无菌操作。（一）常用术语 下列术语常用于表示物理或化学方法对微生物的杀灭程度16二、 消 毒 与 灭 菌1、干热灭菌法采用灼烧或干热空气灭菌 ，使用方便，适用于玻璃器皿和瓷器等耐高温的固体物的灭菌 。2、湿热灭菌法利用热蒸汽杀死微生物。 高压蒸汽灭菌：利用高温高压蒸汽进行灭菌的方法 ，蒸汽的穿透力较热空气强可以杀死一切微生物，包括细菌的芽孢，真菌的孢子或休眠体等耐高温的个体 。最可靠最适用最广泛的灭菌方法。（二）热力灭菌法 使蛋白质、酶及核酸永久性破环，细胞膜溶解，导致细胞发生不可逆转的死亡。17二、 消 毒 与 灭 菌 1、紫外线：波长200-300nm的紫外线具有消毒杀菌作用。穿透

10、物质的能力很差，一般要求紫外灯距离照射物不超过1.0米为宜。 2、电离辐射：高速电子、X射线、射线（三）辐射消毒/灭菌 18二、 消 毒 与 灭 菌（四）滤过除菌法 用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去,以达到除菌目的。滤菌器含有微细小孔0.22微米,只允许液体或气体通过,而大于孔径的细菌等颗粒不能通过 。适用范围：血清、毒素、抗生素以及空气等的除菌。19二、 消 毒 与 灭 菌（五）化学方法 许多化学药物能影响微生物的化学组成、物理结构和生理活性，从而发挥防腐、消毒及灭菌的作用。洁净室(区)应定期消毒，使用的消毒剂不得对设备、物料和成品产生污染。消毒剂品种应定期更换，防止产生耐药菌株。2

11、0二、 消 毒 与 灭 菌 消毒剂消毒原理常用浓度备注乙醇 蛋白质变性、溶解细胞 70%75% 能迅速杀死细菌繁殖体，对一般病毒有一定的消毒作用。一般用95%乙醇稀释成75%的乙醇溶液，常用于皮肤消毒。市售或自配的75%乙醇并非无菌。 新洁尔灭溶液 破坏细菌的胞壁和胞膜，使菌体蛋白变性凝固0.1%0.5%。非氧化性杀菌灭藻剂、黏泥剥离剂和清洗剂。具有洁净、杀菌消毒和灭藻作用，广泛用于杀菌、消毒、防腐、乳化、去垢、增溶等方面。其杀菌活性优于洁尔灭，毒性比洁尔灭低。 碘伏 卤化作用市售碘伏为0.75%、10%、7.5%、5%、1% 广谱杀菌剂，对革兰阳性、阴性菌类、炭疽芽孢菌均有杀灭作用。 甲酚皂

12、溶液 损伤细胞膜 1%5%2%水溶液可用于皮肤消毒甲酚皂比苯酚的杀菌作用强，有毒性，消毒手后有麻木感 21（六）常用消毒方法 二、 消 毒 与 灭 菌仪 器准备和包装灭菌方法时间湿度()滤器清洗后用牛皮纸包裹，分别放在不锈钢小车上高压蒸汽灭菌20min121培养皿用牛皮纸包裹烘箱干热灭菌高压蒸汽灭菌2h20min170121镊子、刮刀清洗后装入金属桶中。烘箱干热灭菌高压蒸汽灭菌2h20min170121吸管(移液管)用清洁器清洗，烘干，分别放入金属筒中烘箱干热灭菌2h170烧杯清洗，用箔封口烘箱干热灭菌2h170小瓶置不锈钢小车上高压蒸汽灭菌不少于15min121微孔滤膜的滤器按原包装或从原包

13、装移去滤器置玻璃培养皿内高压蒸汽灭菌15min12122（七）常用灭菌方法 三、 无 菌 技 术（一）实验环境的要求及无菌操作1.环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行（或C级下的局部A级）。2.阳性实验室、微生物限度检查见、无菌检查间分离。3.严格按无菌操作,防止实验室的培养物被其他外来微生物污染；避免操作者自身被微生物感染。 4.无菌操作在有洁净级别的实验室中进行，与试验相关的金属器械、玻璃器皿、稀释剂等应经过灭菌处理；其他的材料应经过表面消毒、紫外线照射消毒后，再带入实验室 。23三、 无 菌 技 术无菌器材实验器材灭菌器材消毒器材凡是检验中使用的器材，能灭菌

14、处理的，必须灭菌处理。如：玻璃器皿、吸管、培养基、稀释剂、无菌衣、口罩等，在使用前必须经过适当方法灭菌，并在较洁净的环境中保存备用。凡检验用器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。如：无菌室的桌凳、天平、工作台以及工作人员的手等。24三、 无 菌 技 术无菌操作基本概念：无菌操作一般是指在无菌环境条件下，使用无菌制品或无 菌器材进行检验或实验的过程中， 能防止微生物污染与干 扰的一种常规操作方法。操作目的：（1）保证检验物品不被环境中的微生物的污染； （2）防止被检微生物在操作中污染实验人员和实验环境。主要方面：（1）实验前的控制 （2）检验过程的控制 （3）意外事故的控制25三、 无 菌

15、技 术（1）实验前的控制1、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；2、无菌室在使用前开启紫外线灯3060min进行空气消毒；3、在进行接种倾注琼脂平板均需在超净工作台或层流罩内操作；4、检查一切进入无菌环境的器材灭菌、消毒的标志物是否完备；5、洗手消毒：首先用肥皂涂在手上揉搓1015s，肥皂虽不杀菌，有去污作用，然后用流水彻底冲洗，可有效除去手上大多数暂住菌，如连续洗23次(视手的污染程度)，使残余的微生物减少到最低水平，再用消毒液洗手，如新洁尔灭、乙醇等。6、操作人员将手部消毒后，先戴无菌手套，再穿戴无菌工作服(包括鞋、帽、口罩等)。严格的无菌服应是戴帽套头的无扣的上衣，颈部、脸部及袖口是紧口

16、的，以保护身体，防止污染。一般的无菌衣是背开口，围胸部、紧扣颈部与长袖紧口的，以保护身体，防止污染。7、在进入无菌室后，进行检验或实验操作前应再次佩戴无菌手套，实验过程中应用浸有消毒液的棉球或泡沫塑料物消毒手。8、检查过程中应对环境沉降菌及手指表面微生物进行监测。26三、 无 菌 技 术（2）检验过程的控制1、在所有操作中均不应大幅度或快速动作，以免搅动空气中尘埃微粒。2、使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。3、在近火焰区操作。4、使用金属接种器具、用前、用后均需燃烧灭菌。5、用注射器吸取样品、培养物时，注射器内应无空气；装卸针头时应用灭菌的镊子；从密封容器内抽取液体时，应注入无

17、菌空气；带液体的针筒针头应向上倾斜，并用75%乙醇棉球(挤干)保护针头根部；注射时勿用力过猛，以免内容物喷出或针头脱落使溢出液体污染灭菌器材或环境。6、当灭菌瓶塞或试管塞掉落在工作台上，不宜再用，应另换无菌塞，或通过火焰处理后再用。27三、无 菌 技 术（3）意外事故的控制1、当无菌衣受污染，应脱下翻转包裹，使污染部分包在内部，送往消毒，经灭菌后，洗涤再用。2、因偶然打破盛有培养物的器皿，致使病原性的菌种外溢，污染了工作室及操作者的衣物及体表时，首先应冷静，切勿乱动以免扩大污染面。应唤他人用浸透消毒液的毛巾或纱布覆盖于碎片上，或将消毒液倒在污染区，浸没一定时间。先从外至内逐步清理污染源，最后将

18、衣物彻底灭菌。清理时应避免用手指收集玻璃碎片，以防污染皮肤，造成病原性微生物感染事故。3、对一般小面积的污染可自行处理，较大范围的污染则请人协助。28三、 无 菌 技术（二）菌 种菌种保藏原理 保藏的原则是根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以降低菌种的变异率。菌种保藏步骤选择典型菌落确定菌体形态选择保藏方法定期检查方法主要原理适用的微生物包藏时间特点琼脂斜面低温保藏法低温（4）广泛16个月简便液体石蜡保藏法低温，缺氧广泛1年以上简便干燥（砂土）保藏法干燥，无营养产孢微生物110年简便有效冷冻

19、真空干燥法干燥，缺氧、低温广泛5 10年复杂但有效液氮超低温保藏法超低温广泛数十年复杂但有效菌种保藏方法29三、无 菌 技 术琼脂斜面低温保存法方法适用范围特点注意事项 将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好，4度冰箱保藏。每隔1个月移种一次，继续进行保藏。 本法适用与经常使用的细菌、酵母菌等。（1）优点：简便，易推广；一般不需要另选则保藏用培养基；对大多数 都适用。（2）缺点：保藏期短；传代次数多，易变异和污染。 （1）保藏菌种的选择。（2）定期检查。 （3）做好记录。 30三、 无 菌 技 术斜面培养基接种技术方法左手

20、持分离培养的平板培养基，右手持接种环，经火焰烧灼，冷却后在平板上挑取菌落。左手立即放下平板，换持斜面培养基，用右手小指和无名指拔出管塞，夹持于手指之间。将管口在火焰上通过两三次，但勿烧烫。再迅速将挑取有菌的接种环伸进斜面内，从斜面的底部向上划一条接种线，又自下而上蜿蜒接种成曲线。退出接种环，塞上管塞。接种环经火焰灭菌后放置。培养后，沿接种线长出菌苔，非接种线的部位应无细菌生长。31三、 无 菌 技 术菌种的复苏传代及保藏一般为冻干粉剂，安瓿瓶密封包装。增菌性培养选择性培养基分离菌种。斜面接种、培养低温保藏32三、 无 菌 技 术斜面培养基接种技术33四、 培 养 基 基 础 知 识（1）培养基

21、的概念培养基是人工配制的生物营养物质，即用人工的方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配成的一种混合营养物。培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果，每一批培养基在使用前均应进行适用性检查。34四、 培 养 基 基 础 知 识（2）培养基的分类 按状态分类 液体培养基：一种或多种成分组成的水溶液（如：蛋白胨水，营养肉汤）。 固体培养基和半固体培养基：含有不同浓度固化物（如琼脂、明胶）的液体培养基。 按用途分类增菌培养基：通常为液体培养基，能够给微生物的繁殖提供特定的生长环境。选择性增菌培养基：能够允许特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微 生物生长的培养基。 分离培养基：支持微生物生长的固体或半固体培养基。选择性分离培养基：支持特定微生物生长而抑制其他微生物生长的分离培养基。鉴别培养基(特异性培养基)：能够进行一项或多项微生物生理和/或生化特性鉴定的培养基。 鉴定培养基：能够产生一个特定的鉴定反 应而通常不需要进一步确证实验的培养基 35五、 培 养 基 基 础 知 识（3）培养基制备 称量调PH分装包扎 灭 菌按照配方正确称取各种原料放于烧杯杯中。在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。用1N NaOH或