同济医院检验科ISO15189体系文件04可提取核抗原抗体谱（ENA）测定

1、同济大学附属同济医院检验科免疫组项目操作指导书TJYYJYKMY/XMZ704第2版标题：可提取核抗原抗体谱（ENA）测定第7章 第04号第 PAGE 4 页 共 NUMPAGES 4 页1. 目的：检测血清标本中的ENA。2. 适用范围：同济医院检验科免疫室。3. 项目名称：ENA测定。4. 检测方法：免疫印迹法。5. 检测原理：在载片上的每个反应区内固定了2条免疫印迹膜条。膜条上包被了经亲和层析纯化了的抗原平行线。第一步反应，已稀释的病人标本与膜条温育。如果是阳性标本，特异性的ENA抗体将与相应抗原位点结合。用酶标记的抗人IgG（酶结合物）进行第二步温育与之反应，然后加入酶底物以呈颜色反应

2、。6. 试剂：6.1 品牌:购自由德国欧蒙公司。6.2 内含物：每一试剂盒组成为：6.2.1 已被抗原的反应膜条：10张载片；6.2.2 阳性对照血清：l0.2ml；6.2.3 阴性对照血清：l0.2ml；6.2.4 酶结合物：l0.5ml；6.2.5 标本缓冲液：160ml；6.2.6 底物液：l4ml；6.2.7 清洗缓冲液：2100ml；6.2.8 说明书:1份7. 仪器品牌、型号：上海铂斯德牌摇床。8 操作步骤：8.1 打印工作单:8.1.1 打开电脑及打印机电源，8.1.2 双击齐效检验系统，登陆工号与密码；8.1.3 双击报告处理，单击标本申请信息，打开标本申请明细信息查询，打开左

3、上角的所有信息，选择未生成报告信息。8.1.4 在检验项目处选择ENA执行查询，点击打印申请单，打印出工作单。8.2 排列被检测标本:根据工作单上的库位号找出相应标本，并按工作单上的顺序排列。8.3 按以下步骤开始操作:8.3.1 准备试剂和血清标本：8.3.1.1 在使用前，所有试剂及载片应达室温。8.3.1.2 载片:直接使用。与室温平衡后方可打开保护膜，以防止包被面发生冷凝。8.3.1.3 阳性和阴性对照血清:直接使用。8.3.1.4 酶结合物：用清洁的吸管取所需量并用标本缓冲被1:10稀释。例如，吸取30ul酶结合物加到270ul标本稀释液中。8.3.1.5 标本缓冲液:1瓶60ml，

4、直接使用。8.3.1.6 浓缩清洗缓冲液，10倍浓度。用清洁的吸管吸取所需量并用蒸馏水1:10稀释。8.3.1.7 底物液:直接使用。因对光敏感，在使用之前应立即盖紧瓶盖避光存放。8.3.2 稀释血清或血浆标本：血清或血浆标本用标本缓冲液1:101稀释。8.3.3 加样，将加样板放在泡沫塑料板上，加50ul己稀释血清于加样板的每个反应区。避免产生气泡。8.3.4 温育(1)将载片盖在加样板的凹槽里，反应开始。确保每个标本均与载片上的膜条接触，在300rpm摇床上室温温育30分钟。8.3.5 清洗:将清洗缓冲液盛于烧杯中，滴水冲洗载片后，放在小杯玻璃框里浸洗 15分钟。8.3.6 加样:加50u

5、l己1:101稀释的酶结合物(碱性磷酸酶标记的抗人IgG于加样板的每个反应区。8.3.7 温育：将载片从清洗缓冲液中取出，只需擦干背部和四周后置于加样凹槽里。在300rpm摇床上室温温育30分钟。8.3.8 清洗:将缓冲液盛于烧杯中，流水冲洗载片后立即放在小杯的玻璃框里浸洗15分钟。8.3.9 加50ul底物液于加样板的每个反应区。8.3.10 温育：将载玻片从清洗缓冲液中取出，擦千背部及底边后置于加样板的凹槽里。8.3.11 清洗:用去离子水或蒸馏水冲洗载片。风干数分钟。8.4 结果：根据膜条上颜色强度判断结果。与非抗原包被相比，阳性反应将在相应的抗原处可见兰/紫色条带。抗人lgG带(右侧条

6、膜底部)出现清析阳性反应说明实验操作正确，若抗人IgG条带出现微弱反应，需要重复实验。8.5 发送报告：详见免疫报告发送程序。9. 参考范围：正常人阴性。10. 临床意义:10.1 高滴度的IU-nRNP抗体是混合性结缔组织病(MCTD，Sharp综合征)的特征，发生率为95%100%，抗体滴度与疾病活动性相关。UI-nRNP抗体在30%-40%的系统性红狼疮患者也可见。10.2 Sm抗体与系统性红班狼疮密切相关，与dS-DNA一起，是系统性红班狠疮的特异性指标，但仅有20%-40%病人样阳性。10.3 SS-A抗体与各类自身免疫病相关，常见于干燥综合症病人(40%-80%)，也见于系统性红斑

7、狼疮(30%-40%)，原发性胆汁性肝硬化(20%)，偶见于慢性活动性肝炎。此外，100%新生儿红斑狼疮出现SS-A抗休。10.4 抗SS -B抗体见于干燥综合症(40%-80%)和系统性红斑狼疮 (10%-20%.)患者，几乎均为女性(29:l)。干燥综合症常同时有SS-A抗体和SS-B抗体。10.5 Scl-70抗休见于25%-75%的进行件系统性硬化症。10.6 Jo-1抗体见于多肌炎，发生率为25%-35%。常与肺间质纤维化相关。11 病人准备、标本要求：标本为血清时最好空腹采血，脂血、溶血不可使用。其它体液标本无特殊要求。12 注意事项：12.1 接受标本后不能及时检测者应分离血清时，防止溶血。12.2 试剂盒中的所有组分都应当作潜在性