染色质免疫沉淀讲解

1、染色质免疫沉淀Chromatinimmunoprecipitation基因型决定表型破坏了基因型也就改变了表型diploidcontrol亠卢KZMil、.gmd但是，也有一些无法解释的现象在相应的基因碱基序列没有发生变化的情况下，一些生物体的表型却发生了改变。什么是表观遗传学?Iokecpiourchromosomes*g*zxl3FD*JA占wrappedpmiemaUlHucofm.LtiClMTtCii$THCSTUOrOrThmOLECULISTHATOnTROLTHECODE.Theydeterminewhen.v/HfkE.am&howmiruorouronai$used.fwn

2、tlxMesuvecMgpackck)Mt5ojhcr.themoiediucharrodgwHubDHA.TmnumWhe*ijfnaltfrein.gco*letthehHio*CTifHVMfFXtfectMcmrei4theDhU映PlfK7puriWlDMAUlingPCRorp0mryo1IntwrfinucMHKnkt4WEwrwooingOHA.irriQ3W-W如irigmcth.加rrnjpping&lhproim-mAinMrjieikm.CmanlMhpmfinawrthDKft.DyKtlngf&UfCAIH他!mkHWjg实验目的学习掌握染色质免疫沉淀技术的基本原理

3、与关键的操作步骤。2.实验原理使DNA与其结合蛋白交联超声波处理，使染色质断裂为小片段解交联得到基因片段使用特定抗体，免疫沉淀得到靶片段PCR、测序或基因芯片分析所的基因片段的属性实验流程一、交联及染色质DNA剪切条件的优化1.准备一瓶接近长满的HeLa细胞，向培养液中加入37%的甲醛至终浓度为1%,轻轻摇匀，在37C孵育10分钟。甲醛的作用细胞的用量交联条件对实验结果的影响弃培养液，用预冷至4C带蛋白酶抑制剂PMSF的1XPBS洗细胞两次，刮细胞到一个2ml离心管，2000rpm,4C离心4min收集细胞。甲醛的作用在各种交联试剂中，甲醛（HCHO）的应用最为广泛。甲醛的浓度、作用时间及交联

4、的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、精氨酸和组氨酸以及那些DNA的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地在体内交联蛋白质-DNA、蛋白质-RNA以及蛋白质-蛋白质，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠实地保留染色质结构，而且在温和条件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛终浓度为1%,在12-37C作用30mino但是如果反应温度超过30C,本底就可能增加。因此，当必须在高温进行交联时，则应减少作用时间或甲醛浓度。过度交联将影响细胞的裂解，并且在超声处理时不能获得理想长度的DNA片段及影响DNA的溶解。对于特别容易进行交联的目的蛋白质（例如，组蛋白）需减少

5、交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。细胞的用量通常2.5X10*细胞足够进行4次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量,采取培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在50ml离心管中，培养液重悬，计数。（一般分装1x107细胞于个EP管，用于免疫沉淀反应）。交联条件对实验结果的影响对于不同的细胞类型，甲醛的浓度、交联的长度或者交联的温度都需要调整。如果交联不充分，会导致不完全固定，则DNA片段的平均长度会小于500bp。交联过度时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长超声波作用时间也会导致重要原料的丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实

6、验而定。3.用500卩1预热至室温带有蛋白酶抑制剂的SDS裂解液重悬并裂解细能71冰浴10分钟;4超声波处理剪切染色质DNA,使其形成300-1000bp即大约相当于25个核小体长度的片段;超声条件对实验的影响及超声注意事项设置超声破碎的条件酶消化与超声消化相比较的区别超声条件对实验的影响及超声注意事项超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响Chip的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。设置超声破碎的条件

7、超声处理的条件通常可以设置为10秒每次，共3-4次，功率为50W时设置为最大功率的30%,采用2mm超声头。不同的超声处理仪器的设置不太一样，摸索超声条件时，可以先固定其他条件，先确定每次超声多长时间不会导致明显发热，然后摸索不同的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可以使大部分基因组DNA断裂成200JOOObp大小。需要注意的是每次的超声体积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。酶消化与超声消化相比较的区别MicrococcalNuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA蛋白

8、复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经过甲醛固定的NativeChIP(N-ChIP)的研究方法。因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。MiUipore公司有商品化的MicrococcalNuclease处理的ChIP试剂盒(EZ-Enzyme)提供。一用Enzyme和sonication处理结果比较EnzymeU2OSTD超声处理的条件需要优化，各实验组可采

9、用不同的超声波处理条件，比较剪切效果。按以下步骤操作比较各种条件下的剪切效果：实验组12345678超声次数3691136911超声功率15W15W15W15W25W25W25W25Wa.将超声处理过的样品离心收集上清（4C13000rpm离心10分钟），加入lOjil0.5MEDTA、20jilIMTris-HClpH65、2gl20mg/ml蛋白酶K,45C孵育05l小时；.2%琼脂糖b.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20pl的ddH2O凝胶电泳检查。酚/氯仿抽提步骤按照1:1体积比加酚/氯仿充分混匀后离心，取上层水相1!至新管，加入1/10体积3MNacl,2倍体积无水乙醇，大转数离

10、心5min0二、免疫沉淀染色质DNA片段5.将超声处理过的样品在4C13000rpm离心10分钟收集上清，10倍稀释，将其移入一新的2mlEP管中；6.按照每2ml稀释后液体加入75卩1的比例加入蛋白A琼脂糖/鮭精DNA（50%混悬液），4C摇动30分钟，预处理，短暂离心（700-1000rpm4C,小于1分钟），收集上清液;Beads的选择Input的设置7.向2ml上清液中加入适量的抗乙酰化组蛋白H3的抗体（20|il）,4C摇）抗体的选择动过夜，阴性对照组不加抗体同样摇动过夜;对照的设置Beads的选择利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原抗体反应形成DNA蛋白质-抗体复合物，然后使用Agar

11、osebeads或Magnabeads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后,用SDS+NaHCOs洗脱免疫沉淀复合物。Magnabeads是近年来出现的一种新型beads,它使用方便，不像Agarosebeads那样容易破裂，所以在操作过程中更简单，而且免去了离心的步骤，节省不少时间。Millipore公司最新推出的MagnaChIP试剂盒就是采用这种Magnabeads免疫共沉淀和染色质免疫沉淀input设置在进行免疫沉淀步骤前的样品ImmunopedpibtetargetprotelnAJNAcomptexesT(anscn|ii(

12、nFxtorslysecellsIsolatechiomatlnuoonjnatedaitbodySenKate：shear(hromatln染色质免疫沉淀抗体的选择CHIPValidatedHisiuftebSpecificTranscriptionFactorGeneralTMnscriptioftFactorsRNApdllActiveGeneCrres-linkbtecomplex对照的设置IIIChip实验至少应设立3种对照：未经免疫沉淀的超声处理样本（input）；阳性对照。一般用组蛋白抗体或anti-RNAPolymeraseII抗体这些比较保守的在所有细胞中都能结合基因的蛋白的

13、抗体；阴性对照。即用一种无关抗体（或相应动物的免疫前血清），与抗目的蛋白质抗体同时分别与交联染色质样本进行免疫沉淀反应；选择不与目的蛋白质结合的基因组区域作对照，即“基因组对照”。另外，还应根据对ChIP的不同的特殊应用设立不同的实验对照。例如，试图检测目的蛋白质是否与某一推测的结合位点结合，则必须将此位点突变后作为对照；又如，欲测定突变细胞株中目的蛋白质与基因组DNA结合情况时，必须用野生型细胞株作对照等。8加60jil蛋白A琼脂糖/鮭精DNA（50%混悬液），4C摇1小时;9.短暂离心（700-1000rpm,4C,小于1分钟）收集沉淀，分别用低盐免疫复合物洗液、高盐免疫复合物洗液、LiC

14、l免疫复合物洗液洗涤沉淀各一次，每种液体每次用lml,摇动35分钟后短暂离心收集沉淀。然后用同样的方法用TE缓冲液洗涤沉淀两次三、PCR鉴定结合于乙酰化组蛋白H3的DNA片段10.向上步所得沉淀中加入250卩1洗脱液（1%SDS,0.1MNaHCO3）,農荡，室温孵育15分钟，离心收集上清；11加入10gl0.5MEDTAv20glIMTris-HClpH6.5v和2pl20mg/ml蛋白酶K,45C孵育0.5l小时;12酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20卩1的ddH2O中，取冲1作模板，按以下配方加样，PCR扩增实验组和对照组以及Input组的GAPDH启动子序列，扩增条件95C1分钟，95C30秒、55C30秒、72C30秒、30个循环，72C5分钟，1.5%琼脂糖电泳检查结果。此步DNA纯化可以选择适当的DNA纯化试剂盒PCR的策略PCR的策略引物的选择取决于实验目的。如若鉴定目的蛋白质特异结合的位点,除了必须设计一对能使扩增片段跨过该位点的引物外，至少还应设计一对扩增的DNA序列中没有目的蛋白质结合位点的对照引物。对于平均长度为500bp的DNA分子，它的大部分片段长度是500-1000bp,以至远离真正的结合位点lOOObp处的DNA序列很可能被抗体共沉淀下来。所以，对照引物扩增的DNA区域与实验引物扩增的DNA区域