DB32-T 3762.11-2020新型冠状病毒检测技术规范 第11部分：全基因组测序-（高清现行）

1、ICS 11.020C 62DB32江苏省地方标准DB 32/T 3762.112020新型冠状病毒检测技术规范 第 11 部分：全基因组高通量测序Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 11: Whole genome high-throughput sequencing2020 - 07 - 29 发布2020 - 07 - 30 实施江苏省市场监督管理局发 布DB32/T 3762.112020I前言DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术规范目前分为以下部分：第1部分：生物样本采集、运输和保存；第2部分：病毒分离与

2、鉴定；第3部分：核酸荧光PCR检测程序；第4部分：重组酶介导等温扩增程序；第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序；第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序；第7部分：空气样本检测与评估；第8部分：物体表面检测与评估；第9部分：医务人员职业暴露检测与评估；第10部分：微量血清中和试验；第11部分：全基因组高通量测序。本部分为DB32/T 3762 的第11部分。本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本部分由江苏省卫生健康委员会提出。本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附

3、二院、 昆山市疾病预防控制中心。本部分主要起草人：崔仑标、葛以跃、赵康辰、朱小娟、朱宝立、程军平、钱志远、罗晓明、沈欢喜。DB32/T 3762.112020 PAGE 8新型冠状病毒检测技术规范 第 11 部分：全基因组高通量测序范围本部分规定了新型冠状病毒全基因组高通量测序的环境与设施、设备与耗材、试剂、样本前处理与 核酸提取、全基因组测序、结果分析。本部分适用于新型冠状病毒全基因组高通量测序。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489实验室生物

4、安全通用要求新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会医疗机构临床基因扩增管理办法原卫生部办公厅医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则原卫生部检验中心国家卫生计生委对高通量测序试点实验室的要求原国家卫生计生委术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1全基因组测序 whole genome sequencing对生物体整个基因组序列进行测定，以获得完整的基因组信息。3.2高通量测序 high-throughput sequencing能一次并行对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定的技术， 又称“ 下一代” 测序（next-generation sequencing）或

5、深度测序（deep sequencing）技术。3.3Reads高通量测序平台产生的序列称为reads，即测序读到的碱基序列片段，是测序的最小单位。3.4测序深度 sequencing depth测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。3.5测序覆盖度 sequencing coverage测序得到的序列占整个基因组的比例。环境与设施实验室资质及级别要求应符合新型冠状病毒实验室生物安全指南的要求，未经培养的感染性材料的操作在采用可靠的方法灭活前进行核酸提取及临床样本的灭活等操作，应在生物安全二级实验室（BSL-2）进行，同时采 用生物安全三级实验室（BSL-3）的个人防护；感染性材料或活病毒

6、在采用可靠方法灭活后进行的核酸 检测操作应在BSL-2进行。cDNA制备后的相关操作可在生物安全一级实验室（BSL-1）进行。全基因组测序实验室应符合GB 19489、国家卫生计生委对高通量测序试点实验室的要求、医疗机构临床基因扩增管理办法、医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则相关要求。操作人员资质及防护要求实验操作人员应经过生物安全培训并取得实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下准入。样 本制备及核酸提取防护参照DB32/T 3762.3的第4章进行，测序相关操作采用BSL-1的个人防护。设备与耗材设备PCR扩增仪、核酸提取仪、核酸定量仪、高通量测序仪。耗材微量移液器及各种配套带滤芯T

7、ip头、96孔板磁力架、1.5 mL EP管、0.2 mL 8联排管、96孔PCR板。试剂核酸提取试剂盒、核酸定量试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、随机六聚体引物、经验证可靠的适 合多重反应的PCR扩增试剂盒、DNA纯化磁珠、文库制备试剂盒、高通量测序试剂盒。样本前处理与核酸提取参照DB32/T 3762.3的第7章进行。模板制备cDNA 制备以提取的核酸为模板，采用第一链cDNA合成试剂盒和随机六聚体引物，根据试剂盒说明书在PCR 扩增仪上制备第一链cDNA。混合引物将所有扩增引物（附录 A）配置为 100M 储存浓度，将 49 对 Pool 1 的引物各取 5L 混匀，得490L Pool

8、 1 引物池（引物总浓度为 100M），同样将 49 对 Pool 2 的引物各取 5L 混匀，得 490L Pool 2 引物池（引物总浓度为 100M）。以去离子水分别将 Pool 1 和 Pool 2 引物池作 10 倍稀释，使其引物总浓度均为 10M，分装后储存以防止污染和降解。多重 PCR 扩增采用 PCR 扩增试剂盒，根据试剂盒说明书配置多重 PCR 扩增体系，反应体系中每一条引物的终浓度为 0.015M，Pool 1 和 Pool 2 各配置一套扩增体系，每 25L 反应体系中加入 2L cDNA 模板。按以下参数进行 PCR 扩增：98 30s；98 15s，65 5min，扩

9、增 30 循环；4 hold。PCR 产物的纯化将每一份样本的Pool 1 扩增产物和Pool 2 扩增产物混合于新的 8 联排PCR 管或 96 孔PCR 板中。采用 DNA 纯化磁珠法对混合后的扩增产物进行纯化，以 30L TE buffer (10 mM tris-HCl pH8.0,0.1 mM EDTA)洗脱纯化后的产物。DNA 文库构建纯化产物的定量与标化使用核酸定量试剂盒对纯化产物进行双链DNA定量，根据所使用建库试剂盒说明对其进行标化。DNA 文库制备与混合根据所使用的建库试剂盒说明书进行文库制备、定量和文库混合。上机测序根据高通量测序试剂盒和高通量测序仪操作说明完成试剂装载，

10、设置测序参数进行测序。结果分析可采用不同的生物信息学软件进行测序结果的分析：首先去除测序数据中的PCR引物序列（按照最大引物长度30bp进行Trim） 和低质量的Reads， 然后以SARS-CoV-2 参考基因组（ GeneBank号： MN908947.3）为模板进行序列mapping，mapping之后对测序覆盖度和测序深度进行分析，最终生成一致性（consensus）序列，即为待测样本的全基因组序列。附 录 A（规范性附录）多重 PCR 扩增引物序列序号引物名称所属引物池引物序列（5-3）长度1nCoV-2019_1_LEFTPool 1ACCAACCAACTTTCGATCTCTTGT

11、242nCoV-2019_1_RIGHTPool 1AAGTGCCATCTTTAAGATGTTGACG253nCoV-2019_2_LEFTPool 2CTGTTTTACAGGTTCGCGACGT224nCoV-2019_2_RIGHTPool 2TAAGGATCAGTGCCAAGCTCGT225nCoV-2019_3_LEFTPool 1CGGTAATAAAGGAGCTGGTGGC226nCoV-2019_3_RIGHTPool 1AAGGTGTCTGCAATTCATAGCTCT247nCoV-2019_4_LEFTPool 2GGTGTATACTGCTGCCGTGAAC228nCoV-20

12、19_4_RIGHTPool 2CACAAGTAGTGGCACCTTCTTTAGT259nCoV-2019_5_LEFTPool 1TGGTGAAACTTCATGGCAGACG2210nCoV-2019_5_RIGHTPool 1ATTGATGTTGACTTTCTCTTTTTGGAGT2811nCoV-2019_6_LEFTPool 2GGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCG2212nCoV-2019_6_RIGHTPool 2TAGCGGCCTTCTGTAAAACACG2213nCoV-2019_7_LEFTPool 1ATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTA2214nCoV-201

13、9_7_RIGHTPool 1TGCACAGGTGACAATTTGTCCA2215nCoV-2019_8_LEFTPool 2AGAGTTTCTTAGAGACGGTTGGGA2416nCoV-2019_8_RIGHTPool 2GCTTCAACAGCTTCACTAGTAGGT2417nCoV-2019_9_LEFTPool 1TCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGA2418nCoV-2019_9_RIGHTPool 1TTTATGACAGCATCTGCCACAA2219nCoV-2019_10_LEFTPool 2TGAGAAGTGCTCTGCCTATACAGT2420nCoV-201

14、9_10_RIGHTPool 2TCATCTAACCAATCTTCTTCTTGCTCT2721nCoV-2019_11_LEFTPool 1GGAATTTGGTGCCACTTCTGCT2222nCoV-2019_11_RIGHTPool 1TCATCAGATTCAACTTGCATGGCA2423nCoV-2019_12_LEFTPool 2AAACATGGAGGAGGTGTTGCAG2224nCoV-2019_12_RIGHTPool 2TTCACTCTTCATTTCCAAAAAGCTTGA2725nCoV-2019_13_LEFTPool 1TCGCACAAATGTCTACTTAGCTGT2

15、426nCoV-2019_13_RIGHTPool 1ATAACCACAGCAGTTAAAACAC2227nCoV-2019_14_LEFTPool 2CATCCAGATTCTGCCACTCTTGT2328nCoV-2019_14_RIGHTPool 2AGTTTCCACACAGACAGGCATT2229nCoV-2019_15_LEFTPool 1ACAGTGCTTAAAAAGTGTAAAAGTGCC2730nCoV-2019_15_RIGHTPool 1AGAAACAGAAACTGTAGCTGGC2231nCoV-2019_16_LEFTPool 2AATTTGGAAGAAGCTGCTCG

16、GT2232nCoV-2019_16_RIGHTPool 2CACAACTTGCGTGTGGAGGTTA2233nCoV-2019_17_LEFTPool 1CTTCTTTCTTTGAGAGAAGTGAGGACT2734nCoV-2019_17_RIGHTPool 1TTTGTTGGAGTGTTAACAATGCAGT2535nCoV-2019_18_LEFTPool 2TGGAAATACCCACAAGTTAATGGTTTAAC29序号引物名称所属引物池引物序列（5-3）长度36nCoV-2019_18_RIGHTPool 2AGCTTGTTTACCACACGTACAAGG2437nCoV-20

17、19_19_LEFTPool 1GCTGTTATGTACATGGGCACACT2338nCoV-2019_19_RIGHTPool 1TGTCCAACTTAGGGTCAATTTCTGT2539nCoV-2019_20_LEFTPool 2ACAAAGAAAACAGTTACACAACAACCA2740nCoV-2019_20_RIGHTPool 2ACGTGGCTTTATTAGTTGCATTGTT2541nCoV-2019_21_LEFTPool 1TGGTGGCTATTGATTATAAACACTACACA2942nCoV-2019_21_RIGHTPool 1TAGATCTGTGTGGCCAA

18、CCTCT2243nCoV-2019_22_LEFTPool 2ACTACCGAAGTTGTAGGAGACATTATACT2944nCoV-2019_22_RIGHTPool 2ACAGTATTCTTTGCTATAGTAGTCGGC2745nCoV-2019_23_LEFTPool 1ACAACTACTAACATAGTTACACGGTGT2746nCoV-2019_23_RIGHTPool 1ACCAGTACAGTAGGTTGCAATAGTG2547nCoV-2019_24_LEFTPool 2AGGCATGCCTTCTTACTGTACTG2348nCoV-2019_24_RIGHTPool

19、2ACATTCTAACCATAGCTGAAATCGGG2649nCoV-2019_25_LEFTPool 1GCAATTGTTTTTCAGCTATTTTGCAGT2750nCoV-2019_25_RIGHTPool 1ACTGTAGTGACAAGTCTCTCGCA2351nCoV-2019_26_LEFTPool 2TTGTGATACATTCTGTGCTGGTAGT2552nCoV-2019_26_RIGHTPool 2TCCGCACTATCACCAACATCAG2253nCoV-2019_27_LEFTPool 1ACTACAGTCAGCTTATGTGTCAACC2554nCoV-2019_

20、27_RIGHTPool 1AATACAAGCACCAAGGTCACGG2255nCoV-2019_28_LEFTPool 2ACATAGAAGTTACTGGCGATAGTTGT2656nCoV-2019_28_RIGHTPool 2TGTTTAGACATGACATGAACAGGTGT2657nCoV-2019_29_LEFTPool 1ACTTGTGTTCCTTTTTGTTGCTGC2458nCoV-2019_29_RIGHTPool 1AGTGTACTCTATAAGTTTTGATGGTGTGT2959nCoV-2019_30_LEFTPool 2GCACAACTAATGGTGACTTTTT

21、GCA2560nCoV-2019_30_RIGHTPool 2ACCACTAGTAGATACACAAACACCAG2661nCoV-2019_31_LEFTPool 1TTCTGAGTACTGTAGGCACGGC2262nCoV-2019_31_RIGHTPool 1ACAGAATAAACACCAGGTAAGAATGAGT2863nCoV-2019_32_LEFTPool 2TGGTGAATACAGTCATGTAGTTGCC2564nCoV-2019_32_RIGHTPool 2GGTAATAGCACATCACTACGCAAC2465nCoV-2019_33_LEFTPool 1ACTTTTG

22、AAGAAGCTGCGCTGT2266nCoV-2019_33_RIGHTPool 1TGGACAGTAAACTACGTCATCAAGC2567nCoV-2019_34_LEFTPool 2TCCCATCTGGTAAAGTTGAGGGT2368nCoV-2019_34_RIGHTPool 2AGTGAAATTGGGCCTCATAGCA2269nCoV-2019_35_LEFTPool 1TGTTCGCATTCAACCAGGACAG2270nCoV-2019_35_RIGHTPool 1ACTTCATAGCCACAAGGTTAAAGTCA2671nCoV-2019_36_LEFTPool 2AT

23、TACAGTTAATGTTTTAGCTTGGTTGTA2272nCoV-2019_36_RIGHTPool 2GAACAAAGACCATTGAGTACTCTGGA2673nCoV-2019_37_LEFTPool 1ACACACCACTGGTTGTTACTCAC2374nCoV-2019_37_RIGHTPool 1GTCCACACTCTCCTAGCACCAT2275nCoV-2019_38_LEFTPool 2ACTGTGTTATGTATGCATCAGCTGT2576nCoV-2019_38_RIGHTPool 2ATCATAAACACCAAGAGTCAGTCTAAA25序号引物名称所属引物

24、池引物序列（5-3）长度77nCoV-2019_39_LEFTPool 1AGTATTGCCCTATTTTCTTCATAACTGGT2978nCoV-2019_39_RIGHTPool 1TGTAACTGGACACATTGAGCCC2279nCoV-2019_40_LEFTPool 2TGCACATCAGTAGTCTTACTCTCAGT2680nCoV-2019_40_RIGHTPool 2CATGGCTGCATCACGGTCAAAT2281nCoV-2019_41_LEFTPool 1GTTCCCTTCCATCATATGCAGCT2382nCoV-2019_41_RIGHTPool 1TGG

25、TATGACAACCATTAGTTTGGCT2583nCoV-2019_42_LEFTPool 2TGCAAGAGATGGTTGTGTTCCC2284nCoV-2019_42_RIGHTPool 2CCTACCTCCCTTTGTTGTGTTGT2385nCoV-2019_43_LEFTPool 1TACGACAGATGTCTTGTGCTGC2286nCoV-2019_43_RIGHTPool 1AGCAGCATCTACAGCAAAAGCA2287nCoV-2019_44_LEFTPool 2TGCCACAGTACGTCTACAAGCT2288nCoV-2019_44_RIGHTPool 2AA

26、CCTTTCCACATACCGCAGAC2289nCoV-2019_45_LEFTPool 1TACCTACAACTTGTGCTAATGACCC2590nCoV-2019_45_RIGHTPool 1AAATTGTTTCTTCATGTTGGTAGTTAGAGA3091nCoV-2019_46_LEFTPool 2TGTCGCTTCCAAGAAAAGGACG2292nCoV-2019_46_RIGHTPool 2CACGTTCACCTAAGTTGGCGTA2293nCoV-2019_47_LEFTPool 1AGGACTGGTATGATTTTGTAGAAAACCC2894nCoV-2019_47

27、_RIGHTPool 1AATAACGGTCAAAGAGTTTTAACCTCTC2895nCoV-2019_48_LEFTPool 2TGTTGACACTGACTTAACAAAGCCT2596nCoV-2019_48_RIGHTPool 2TAGATTACCAGAAGCAGCGTGC2297nCoV-2019_49_LEFTPool 1AGGAATTACTTGTGTATGCTGCTGA2598nCoV-2019_49_RIGHTPool 1TGACGATGACTTGGTTAGCATTAATACA2899nCoV-2019_50_LEFTPool 2GTTGATAAGTACTTTGATTGTTA

28、CGATGGT30100nCoV-2019_50_RIGHTPool 2TAACATGTTGTGCCAACCACCA22101nCoV-2019_51_LEFTPool 1TCAATAGCCGCCACTAGAGGAG22102nCoV-2019_51_RIGHTPool 1AGTGCATTAACATTGGCCGTGA22103nCoV-2019_52_LEFTPool 2CATCAGGAGATGCCACAACTGC22104nCoV-2019_52_RIGHTPool 2GTTGAGAGCAAAATTCATGAGGTCC25105nCoV-2019_53_LEFTPool 1AGCAAAATG

29、TTGGACTGAGACTGA24106nCoV-2019_53_RIGHTPool 1AGCCTCATAAAACTCAGGTTCCC23107nCoV-2019_54_LEFTPool 2TGAGTTAACAGGACACATGTTAGACA26108nCoV-2019_54_RIGHTPool 2AACCAAAAACTTGTCCATTAGCACA25109nCoV-2019_55_LEFTPool 1ACTCAACTTTACTTAGGAGGTATGAGCT28110nCoV-2019_55_RIGHTPool 1GGTGTACTCTCCTATTTGTACTTTACTGT29111nCoV-2

30、019_56_LEFTPool 2ACCTAGACCACCACTTAACCGA22112nCoV-2019_56_RIGHTPool 2ACACTATGCGAGCAGAAGGGTA22113nCoV-2019_57_LEFTPool 1ATTCTACACTCCAGGGACCACC22114nCoV-2019_57_RIGHTPool 1GTAATTGAGCAGGGTCGCCAAT22115nCoV-2019_58_LEFTPool 2TGATTTGAGTGTTGTCAATGCCAGA25116nCoV-2019_58_RIGHTPool 2CTTTTCTCCAAGCAGGGTTACGT2311

31、7nCoV-2019_59_LEFTPool 1TCACGCATGATGTTTCATCTGCA23序号引物名称所属引物池引物序列（5-3）长度118nCoV-2019_59_RIGHTPool 1AAGAGTCCTGTTACATTTTCAGCTTG26119nCoV-2019_60_LEFTPool 2TGATAGAGACCTTTATGACAAGTTGCA27120nCoV-2019_60_RIGHTPool 2GGTACCAACAGCTTCTCTAGTAGC24121nCoV-2019_61_LEFTPool 1TGTTTATCACCCGCGAAGAAGC22122nCoV-2019_61_

32、RIGHTPool 1ATCACATAGACAACAGGTGCGC22123nCoV-2019_62_LEFTPool 2GGCACATGGCTTTGAGTTGACA22124nCoV-2019_62_RIGHTPool 2GTTGAACCTTTCTACAAGCCGC22125nCoV-2019_63_LEFTPool 1TGTTAAGCGTGTTGACTGGACT22126nCoV-2019_63_RIGHTPool 1ACAAACTGCCACCATCACAACC22127nCoV-2019_64_LEFTPool 2TCGATAGATATCCTGCTAATTCCATTGT28128nCoV

33、-2019_64_RIGHTPool 2AGTCTTGTAAAAGTGTTCCAGAGGT25129nCoV-2019_65_LEFTPool 1GCTGGCTTTAGCTTGTGGGTTT22130nCoV-2019_65_RIGHTPool 1TGTCAGTCATAGAACAAACACCAATAGT28131nCoV-2019_66_LEFTPool 2GGGTGTGGACATTGCTGCT22132nCoV-2019_66_RIGHTPool 2TCAATTTCCATTTGACTCCTGGGT24133nCoV-2019_67_LEFTPool 1GTTGTCCAACAATTACCTGA

34、AACTTACT28134nCoV-2019_67_RIGHTPool 1CAACCTTAGAAACTACAGATAAATCTTGGG30135nCoV-2019_68_LEFTPool 2ACAGGTTCATCTAAGTGTGTGTGT24136nCoV-2019_68_RIGHTPool 2CTCCTTTATCAGAACCAGCACCA23137nCoV-2019_69_LEFTPool 1TGTCGCAAAATATACTCAACTGTGTCA27138nCoV-2019_69_RIGHTPool 1TCTTTATAGCCACGGAACCTCCA23139nCoV-2019_70_LEFT

35、Pool 2ACAAAAGAAAATGACTCTAAAGAGGGTTT29140nCoV-2019_70_RIGHTPool 2TGACCTTCTTTTAAAGACATAACAGCAG28141nCoV-2019_71_LEFTPool 1ACAAATCCAATTCAGTTGTCTTCCTATTC29142nCoV-2019_71_RIGHTPool 1TGGAAAAGAAAGGTAAGAACAAGTCCT27143nCoV-2019_72_LEFTPool 2ACACGTGGTGTTTATTACCCTGAC24144nCoV-2019_72_RIGHTPool 2ACTCTGAACTCACT

36、TTCCATCCAAC25145nCoV-2019_73_LEFTPool 1CAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGT29146nCoV-2019_73_RIGHTPool 1CACCAGCTGTCCAACCTGAAGA22147nCoV-2019_74_LEFTPool 2ACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGC28148nCoV-2019_74_RIGHTPool 2GCAACACAGTTGCTGATTCTCTTC24149nCoV-2019_75_LEFTPool 1AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGT26150nCoV-2019_75_

37、RIGHTPool 1ACCACCAACCTTAGAATCAAGATTGT26151nCoV-2019_76_LEFTPool 2AGGGCAAACTGGAAAGATTGCT22152nCoV-2019_76_RIGHTPool 2TCTCTGCCAAATTGTTGGAAAGGCA22153nCoV-2019_77_LEFTPool 1CCAGCAACTGTTTGTGGACCTA22154nCoV-2019_77_RIGHTPool 1CAGCCCCTATTAAACAGCCTGC22155nCoV-2019_78_LEFTPool 2CAACTTACTCCTACTTGGCGTGT23156nC

38、oV-2019_78_RIGHTPool 2TGTGTACAAAAACTGCCATATTGCA25157nCoV-2019_79_LEFTPool 1GTGGTGATTCAACTGAATGCAGC23158nCoV-2019_79_RIGHTPool 1CATTTCATCTGTGAGCAAAGGTGG24序号引物名称所属引物池引物序列（5-3）长度159nCoV-2019_80_LEFTPool 2TTGCCTTGGTGATATTGCTGCT22160nCoV-2019_80_RIGHTPool 2TGGAGCTAAGTTGTTTAACAAGCG24161nCoV-2019_81_LEFTPo

39、ol 1GCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGG25162nCoV-2019_81_RIGHTPool 1GTGAAGTTCTTTTCTTGTGCAGGG24163nCoV-2019_82_LEFTPool 2GGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCT25164nCoV-2019_82_RIGHTPool 2TGCCAGAGATGTCACCTAAATCAA24165nCoV-2019_83_LEFTPool 1TCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCA25166nCoV-2019_83_RIGHTPool 1TTTGACTCCTTTGAGCACTGGC22167nCoV-2019_84_LEFTPool 2TGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCT22168nCoV-2019_84_RIGHTPool 2AGGTGTGAGTAAACTGTTACAAACAAC27169nCoV-2019_85_LEFTPool 1ACTAGCACTCTCCAAGGGTGTT22170nCoV-2019_85_RIGHTPool 1ACACAGTCTTTTACTCCAGATTCCC25171nCoV-2019_86_LEFTPool 2TCAGGTGATGGC