四川大学-生物技术-综合实验报告-学生版

1、v1.0可编辑可修改25 生物技术综合实验甘薯丫谷氨酰半胱氨酸合成酶(tGCS)基因的克隆和原核表达学生：学号：同实验者：研究背景谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH 具有多种重要生理功能,抗自由基和抗 氧化应激作用,保护细胞膜的完整性等。T -GCS是植物细胞中GShft物合成的 限速酶，可以调控GSH勺生物合成量。GSH生物体抵御冷害、干旱、重金属、 真菌等胁迫过程中起着重要作用，说明丫-GCS也与植物抗逆过程密切相关。实验一甘薯叶片RN也取一、实验目的. 了解真核生物RNA1取的原理；.掌握Trizol提取的方法和步骤。二、实验原理Trizol试剂是由苯酚和硫鼠酸月瓜配制

2、而成的单相的快速抽提总RNA勺试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中 的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNAB活性，因此TRIzol中还加入了 8羟基唾咻、异硫氟酸月瓜、B -琉基乙醇 等来抑制内源和外源RNase (RNA#)。啕勺8羟基唾咻可以抑制 RNase，与氯仿 联合使用可增强抑制作用。异硫氟酸胴属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂， 可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失， 导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸 分离。B -琉基乙醇的主要作用

3、是破坏 RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、 离心分离后，RNAt于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀 RNA用这种方法得 到的总RNA中蛋白质和DNA亏染很少。三、实验材料.材料甘薯（Ipomoea batatas Lam ）叶片，品种为徐薯 18.试齐1J 无RNA#灭菌水：加入%勺DEPC处理过夜后高压灭菌；Trizol 试剂；氯仿；异丙醇、75%乙醇；TBE缓冲液；上样缓冲液（6X）.仪器高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和 EP管架四、实验方法.将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每 50-100 mg植

4、物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min ,使样品充分裂解；.每1 mLTrizol试剂加入200卜L氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置 3-5 min 使其自然分相；. 4 C 12,000 rpm 离心15 min,吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置 15 min；. 4 C 12,000 rpm 离心10 min,弃上清，RNAM淀于管底；. RNA沉淀中加入1 mL75%勺乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管， 悬浮沉淀； 4c 8,000 rpm 离心2 min ,弃上清；.室温放置10 min晾干沉淀；.沉淀中加入20

5、pL RNasefree ddH2O轻弹管壁，以充分溶解 RNA -70C保 存；.用1%勺琼脂糖凝胶电泳进行检测，用 EB染色并照相。五、实验结果RNA取结果依照Trizol 试剂盒方法，提出的RNAR少，此部分未以图或数据显示。RNA后电泳结果如图1.其中9a为本组实验结果。由图可知 RNA带非常模糊，拖尾现象 严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提 取过程中并未很好除去。图1. RN砒取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker, 9a泳道为本小组 RNA羊品。与标 准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。六、分析与讨论RNA的提取产量并不多，可能是因裂解样品不充分

6、或 RNAC淀未完全溶解所致。在实验 过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、 操作技巧不完善，留上清与弃上清时令 RN颇失了部分,使最终 RNA量不理想。RNA电泳结果有EB存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应看得很清楚，另 出现条由tRNA rRNA和5s rRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果 RNA9:有 降解，则28S rRNA的亮度应为18SrRNA的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。 由图1. 9a可知，RNAfi尾现象严重，说明RNAG大部分被降解；此外点样孔附 近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。在进行实验时，本小组成

7、员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源 RNAasei入样品，导致其降解严重。另外，提取出 RNAf本小组未立即将样品 放入-70C保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层 的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽， RN厩带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。七、总结：本次试验RNAIS取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。虽然大实验无法 避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图 1. 2a, 3a, 2b等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对 结果干扰不大。那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了

8、很大失误。首先口罩、手套应该严格按规定佩戴，提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细，尽量避免混入杂质。其次为排除部分杂质影响可对 RNA 羊品用紫外线分光光度计测 定吸光值检验，将有助于结果分析。最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免 接下来的实验出现类似问题。实验二 第1链cDNA勺合成和模板的验证、实验目的1.掌握第1链cDNA勺合成方法和步骤二、实验原理真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工才能成为成熟 mRNA以真核成熟mRNM模板合成cDNA进而获得有连续氨基酸编码的 DNA予 列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。真核生物的mRN都有PolyA尾巴。引物：Olig

9、o dT （12-18个T）。莫洛尼 氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV）以单链RNA模板，在引物的引发下合成与模 板互补的DNA! （cDNA。nrRlhJA：虫如星super RriaseH- gamriRMCDKPReverse ranscriptaseTITIImRNA反转录生成的cDNAM#为PCR勺模板进行扩增称为 RT-PCR RT-PCR 比Northern杂交更灵敏，对RNA勺质量要求较低，操作简便，它是在转录水平 上检测基因时空表达的常用方法。三、实验材料.材料徐薯18叶片RNA羊品.试齐1JdNTP mixture (10 mM each)；Oligo (dT) Prime

10、r (10 仙 M)；Total RNA ;RNase free ddH2O ；M-MLV反转录酶；5 x F irst-strand Buffer ；M DTT;Ribonuclease Inhibitor (40 U/ 仙 L)3.仪器10仙L和100仙L的移液枪、的EP管、PCR0Z等四、实验方法1.在RNase free Microtube管中配制下列混合液： TOC o 1-5 h z dNTP mixture (10 mM each)1 pL*Oligo (dT) Primer (10 M)4LTotal RNA2 LRNase free ddH 2Oup to 121i L.将混

11、合物65 C加热5 min ,迅速在冰上冷却2 min，快速离心，然后加入 下列成分：5x First - strand Buffer4pLM DTT2p LRibonuclease Inhibitor (40 U/ 仙 L) 1仙 L.将混合物轻轻混匀，37c温浴2 min；.加入M-MLVg转录酶( 200U/pL) 1仙L,用枪头轻轻吹打混匀；. 37 C 温浴 50 min ;6.70 C加热15 min,使反转录酶失活，所得反转录产物可直接用于PC阪应附反转录模板的看家基因的验证(B -actin )引物primerssequencessizeIbActinFIbActinR5-TT

12、CCCCGGTATTGCGGATAGAATG-35-CGGACCGGACT CATCATACTCT G -3，198bp以第一链cDNA为模板，B -actin-F 和0-actin-R 为引物，使用Taq酶进行PCR表1 B -actin PCR 反应体系(25仙L体系)DNA真板1.L(约 50 ng)10X PCRg冲液(Mg2+ plus)N LMg2+N L10 mol/L TPS -F1 n L10 mol/L TPS -R1 N Lmmol/L dNTPN LTaq酶N L火菌去离子水N L合计25 /i L* PCR反应条件94 c 2min 、95 c 30secI3 30个

13、循环62 c 30secJ68 c 30sec最后，1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物。五、实验结果1. B -actin 验证如图1.其中编号1为Marker, 3为本小组RNA羊品0-actin 验证结果。由图可知，使用RNA真板通过RT-PCR马至IJ了长度为198bp类似条带，但因产物 浓度较低，该条带不甚清晰，并有部分弥散现象发生。图1. 3-actin 验证电泳结果。其中编号1为Marker,编号3为本小组RNA羊品经RT-PCR 在加入引物IbActinF 、IbActinR 后扩增出的 0 -actin 产物。六、分析与讨论RNA提取因实验一本小组RNA1取失败，故此实验采用老师

14、准备的 RNA!行验证。B -actin 验证结果如图1.第3组为本小组验证结果。其中 B-actin能被cDNA真板扩增出， 但条带模糊并有拖尾现象出现。首先，因所得产物量较少，故电泳条带模糊，推 测可能是在进行RT-PCRO, RNAT部分降解或于操作过程中损失部分所致。其 次，本实验在对B-actin产物进行电泳后结果出现拖带，可能原因主要有：1)cDNA一链产物的含量过高；2) DNase降解DNAT生的寡核甘酸有非特异性扩 增；3) PCR5应中引物过多；4)循环次数过多；5)退火温度过低；6) Taq酶 过多；7) Mg2然度不合适。综合本次试验分析，因实验条件已预先经过尝试， 故

15、导致拖带的最可能因素应为cDNA窜解产生了寡核甘酸非特异性扩增片段。由 于照片清晰度欠佳，非特异性扩增片段无法清晰显示，但若与图2.进行对比则可发现第2组B-actin验证图出现了非特异性扩增片段。图2.第2组3-actin 验证图。其中1为Marker ,编号2、6可见清晰的两条带。若要进行改进，则需尽量提取高质量 RNA防止其被DNA亏染。另外进一步 优化PCRK应条件也是必不可少的环节，提高退火温度可防止非特异性起始与延 伸。七、总结本次实验虽只进行了模板验证，但让我们理解了RT-PCR勺原理与其在真核生物基因克隆方面的运用。整个过程中本小组成员较严格按照操作规范进行，所得B-actin

16、产物验证也较成功。今后实验需更加注意细节，不断完善自己的操作技巧，积累经验。实验三 甘薯丫 -谷氨酰半胱氨酸合成酶（丫 -GCS理因克隆一、实验目的1.掌握PCR的方法和步骤。二、实验原理聚合酶链反应（PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特 异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；目的基因或 某一 DNAt段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核甘酸引物。PCRi变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA勺变性：模板DNAS加热至一定温度后，使模板DNW链解离，成为 单链，与引物结合，为以下的反应作准备；模板DN

17、Af弓I物的退火(复性)：模板DNAS加热变性成单链后，温度降至55c 左右，引物与模板DNAI链的互补序列配对结合。引物的延伸：DNA真板引物结合 物在TaqDNAS合酶的作用下，以dNT吻 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”， 而且这 种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将 待扩目的基因扩增放大几百万倍。三、实验材料.材料反转录产物DNA羊品.试齐1JdNTP mixture (10 mM each)；第一 cDNA ;B-ac

18、tin 的引物 (IbActinF 和 IbActinR )；丫-GCS的引物 (丫-GCS-F 和 丫-GCS-R );10 X PCRg冲液(Mg2+ plus);Taq酶；.仪器PCR仪、l L 10仙L和100仙L的移液枪、的EP管、电泳仪。四、实验方法.扩增甘薯丫-GCS基因的引物primerssequencesSize丫 -GCS-F丫 -GCS-R:5- CGGGATATGGCGTTGATGTCCCAATCTG-3斜体：BamHI酶切位点1575bp:5- CCGCTCGACAATAGAGCAGCTCCTCAAATAC-3斜体：XHOI酶切位点.甘薯丫-GCS基因的PCRT增甘薯

19、丫-GCS基因的PCRT增体系（表2） （25nL体系）以第一链cDNA模板，F和R为引物，使用Taq酶高保真酶进行PCR表 2 T -GCSPCR反应体系DNA真板1.L(约 50 ng)10XPCF冲液(Mg2+ plus)N LMg+N L10 mol/L 丫-GCS -F1 L10 mol/L 丫-GCS -R1Lmmol/L dNTPN LTaq酶N L火菌去离子水14 pL合计25 L.PCR反应条件94 c 4min94 c 40sec 、65c 30secC 35 个循环72 c 2min1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物，并进行胶回收纯化；3.甘薯丫-GCS基因PCR物胶回收一

20、一按照胶回收试剂盒的说明书进行：1）将PCR物在1%琼脂糖凝月$中电泳，5V/cm电泳1 h后,澳乙锭（或者Goldview）染色，在紫外灯下切下2500 bp左右大小片段的凝胶；2）称凝胶重量，按1 g/mL体系加Binding buffer ，在55 C水浴中孵5 min ,直到凝胶完全溶解；3）将凝胶溶液到 DNAspin-column中，室温放置2min , 1,2000 rpm离心1 min,弃废液；4）用 700 L washing buffer洗涤柱子，1,2000 rpm 离心 1 min；5）弃废液后再1,2000 rpm 离心2min,以除去残存的 washing buff

21、er ；6）把column放到另一干净的 mL离心管，力口 50 pL elution buffer ,室温放置2 min 后，1,2000 rpm 离心 1 min 以洗脱 DNA. pET-32a质粒的BanHI和XHO双酶切酶切体系（10仙L体系）： TOC o 1-5 h z buffer (BanHI)1LBanHI业 LXhoI口质粒小L 酶切反应：37c水浴中孵化1h；.甘薯丫-GCS合成酶基因胶回收产物的BamHI和XHO双酶切 酶切体系（10仙L体系）：buffer （ BanHI）1口BanHI业 LXhoI口PCR交回收产物卜L 酶切反应：37c水浴中孵化1h 0五、实验

22、结果1.甘薯丫-GCS基因PCR电泳图如图1.其中1为Marker （最大片段2kb）, 4a为本小组甘薯丫 -GCS基因PCRT增产物。由图可知该组各条带均较明亮清晰，模板经引物R F扩增后得大小在1575bp左右的目标产物，即约，跟 Marker对比并进行了标注（图1.红 色框）。另图中除标注部分以外还出现多余条带，但因后续实验采取割胶回收方 式获得丫-GCS基因片段，故其余片段不会对实验结果造成影响。T -GCS基因左右右图1.甘薯丫 -GCS基因PCR电泳图。其中编号 1为Marker , 4a为本小组 丫 -GCS基因电泳结果。红框已圈出丫-GCS所在条带位置，大小在左右。六、分析与

23、讨论.甘薯丫-GCS基因PCR电泳结果由图1.4a可知，本次甘薯丫-GCS基因PCRR为成功。该产物条带比较明亮，边缘整齐，但除目的条带外仍扩增出了不少多余条带，说明DNA真板存在小部分降解。实验过程中应尽量避免 DNAase亏染以及机械剪切力损伤样品，而操 作时更应注意加样时间，经分析电泳结果出现非目的基因小片段可能是加样时间 过长引起的。另外，本实验在电泳时还可设计阴性对照（灭菌去离子水、缓冲液），以使结果更加完善。.胶回收与双酶切由于严格按照实验步骤进行，胶回收与双酶切均完成较好。此处未以数据、 图片表小。七、总结本次实验包括PCR 丫-GCS基因片段（目的基因）并作电泳检测、胶回收纯

24、化目的基因以及BanHI、Xhd双酶切质粒与目的基因三个步骤。由实验结果可知 目的基因扩增较为成功，虽有多余杂质出现但条带仍然清晰、整齐。胶回收时， 溶液放置2min是为使buffer与产物溶液混合均匀并稳定以减少杂质影响，最后 双酶切的孵化时间与温度是关键， 故于操作过程中我们应注重细节，多体会才能 理解、掌握成功要领。实验四原核表达质粒构建一、实验目的1.掌握连接和转化步骤。二、实验原理DNA体外连接即在一定条件下，由DNA1接酶催化两个双链DNAt段相邻5 端磷酸、3端羟基间形成磷酸二酯键的过程，DN砌子的连接是在酶切反应获 得同种酶互补序列基础上进行的。连接反应成功与否，最后的检测要转

25、化宿主菌、 阳性克隆的筛选来确定。质粒转化不同细菌有不同的转化效率， 转化效率的高低 与实验的成败直接相关，通常转化效率可达 105-107转化子/仙g DNA获得高转 化效率的关键是感受态细菌的制备。体外通过基因工程手段所构建含目的基因的重组质粒，通过转化和筛选技术，可获得含重组子的阳性克隆。在此阳性克隆中， DNAT在生物体系内大量扩 增、繁殖、保存及表达目的基因产物，这是 PC神外扩增DNAT不能替代的。配 合DNA组技术所获得的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领 域。三、实验材料.材料甘薯丫-GCS基因酶切片段、载体片段.试齐1J10 XT4 DNA ligase buf

26、fer ；T4 DNA ligase ;ddH2O;SOC培养液；buffer BamHI ；DMSQTFB 溶液（100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl 2, 10 mmol/L CaCl 2,10 mmol/L K-MES ;B-琉基乙醇；.仪器：10 pL和200仙L移液枪、的EP管、离心机、培养皿、电泳仪、37 C培养 箱、4 c冷藏室四、实验方法.甘薯丫-GCS基因酶切产物与pET-32a酶切产物的连接连接体系（10仙L体系）：10X T4 DNA ligase buffer1 a Lv1.0可编辑可修改25 v1.0可编辑可修改 6 TOC o 1-5 h z

27、 载体片段4仙LPCRtt切片段3仙LT4 DNA ligaseLddH2O仙 L连接条件：16c连接过夜；.大肠杆菌感受态细胞的制备1）接种JM109于2 mL SOB培养基中，37c振荡培养过夜；2）取mL菌液转种于50 mL SOB培养基中，37c振荡培养h（OD 550值约为后，冰浴10 min , 4, 000 r/min 离心5 min ,弃上清液；3）加入 17mL预冷的 TFB溶液（100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl 2, 10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L K-MES 洗涤菌体1次,离心收集菌体;4） 加入4 mL TFB制成悬液，冰

28、浴10 min,加入140仙L二甲基亚碉（DMSO） 冰浴上轻轻转动10 min,加入140 pL 0-琉基乙醇，于冰浴上轻轻转动10 min, 再加入140 L DMSO轻轻混匀后在冰浴上静置 5 min ,即得感受态细胞；3.连接产物的转化1）在预冷的EP管中加入1-10 pL质粒DNA加入200上述感受态细胞，混匀后在冰浴上静置30 min；2） 42c水浴热冲击30 s,冰浴上放置10 min,加入mL SOCS养液。置于37 C 振荡培养1 h;3）取mL涂布于加有抗生素的LB培养基平板上，37 C培养过夜。若转化子很 少，特别是连接DNA勺转化，可将*$化细胞离心3 min （4,

29、000 r/min）,弃上清 液，把所有的菌体涂布在含相应抗生素的平板上；4）正放于37c培养箱内约1h使接种物完全被吸收，然后将平板倒置于 37c培 养箱中培养，1216h后，将平板移入4c （冰箱冷藏室）放置数小时；.质粒的小量提取：采用试剂盒（Plasmid Mini Kit I ）方法进行提取 实验前准备：1）使用前，将RNase/部加入Solution I中并于4度保存；2）按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer,并于室温保存；D6942-00, 3:加入ml无水乙醇D6942-01,D6943-01:加入 80ml无水乙醇D6842-02,D6943-02 :每瓶中加入

30、80ml无水乙醇离心操作方案：1）将带有质粒的 接种于5ml LB/抗生素培养液中，37第床培养1216 h;2）取的菌液，室温下10,000 xg离心1min收集细菌；3）倒弃培养基。加入250ul Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬 浮；4）往重悬混和液中加入250ul Solution II ,轻轻颠倒混匀4-6次。此操作避免 剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5 min ；5）加入350ul Solution III ,温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀；6）室温下， 10, 000 xg 离心 10min；7）转移上精液至套有2ml收集管的HiBind DNA结

31、合柱中，室温下10,000 xg离心1 min,倒去收集管中的滤液；8）把柱子重新装回收集管，加入500ul HBBuffer ,按上述条件离心，弃去滤液；9）把柱子重新装回收集管，加入700ul DNAWashBuffer ,按上述条件离心，弃 去滤液。注浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释；10）弃去滤液，重复第9步骤一次；11）弃去滤液，把柱子重新装回收集管，10,000 xg离心空柱2min以甩干柱子基质。注不要忽略此步这对去除柱子中残留的乙醇至关重要；12）把柱子装在干净的离心管上，加入 30-50ul Elution Buffer（10mM

32、Tris-HCl, 或无菌水到柱子基质中，静置1- 2min , 10,000 xg离心1min洗脱出DNA.重组子的PC既定。五、实验结果:v1.0可编辑可修改 0v1.0可编辑可修改 .重组质粒粗提检测如图1.粗提后均出现了大小不同的质粒， 较小者应为pET-32a质粒载体以 及原有质粒，较大者为重组质粒，而重组阳性质粒则需后续实验鉴定。其中 4a 为本小组提取结果，由于拍照条件不佳，最大条带较模糊（图中红色方框圈出）， 但仍能辨别出3条带。原有质粒与pET-32a质粒空载体条带最亮，而成功转化的 重组质粒条带相对暗淡，很难分辨清楚。图1.重组质粒粗提电泳检测图。 其中4a为本小组样品条带

33、，红框圈出部分为重组质粒， 量较少。.重组质粒PC谕测如图2.所示，2b即本小组实验条带，9为Marker条带（同实验三）。以大 质粒为模板，y -GCS-F、R为引物进行PCR得左右条带十分清晰，已由图中标 出。图2.重组质粒PCR电泳检测图。其中 9为Marker条带，2b由红箭头所指为本小组重 组质粒PC疏带，大小在左右。六、分析与讨论.重组质粒粗提电泳结果如图1.可大致观察到重组质粒的形成，但由于产量较少，重组质粒的转化 率不好，分析可能是在进行目的基因与载体连接时成功率较低所致。另因图中无Marker显示，对重组质粒的条带确认增加了难度，单一完整pET-32a质粒与E.Coli受体菌

34、自身已携带质粒的电泳条带可起辅助分析作用，以使电泳结果更完 整。.重组质粒PCRfe泳结果图2. 2b条带较为清晰整齐，说明有阳性重组质粒形成，转化成功。但条带稍有拖尾现象产生，分析可能是由PCR程中升温所导致的质粒不规则变性、断裂而引起，并形成了些大小不一的片段，电泳时呈弥散状分布于主条带后， 分子 量较大。七、总结v1.0可编辑可修改25 本次试验过程中，因酶切鉴定结果不理想而改用 PCRI定。对质粒进行提取 时的机械力损伤、PC研温步骤均可导致质粒片段受损，这些失误在操作或实验 设计方面都需尽量避免，虽然重组质粒量较少但其能成功转化受体菌， 这也为随 后IPTG诱导目的基因表达丫-GCS

35、产物打下了一定基础。多做、多思考、多总结, 才能于每个环节中学习到更多知识。实验五甘薯丫-GCSS因的原核表达一、实验目的1,使用IPTG诱导外源基因表达，了解筛选原理；2.掌握SDS-PAG检测表达蛋白质的原理与方法。二、实验原理.表达系统是重要的原核表达体系。在重组基因转化入菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDSZ检测表达蛋白质。本实验采用异内基硫代-B-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。lacI是大肠杆菌中lac操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋 白是lac操纵基因（Operator）的抑制因子，抑制转录启动。当有乳糖存在时

36、， 这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac操纵子上的结构基因lacZ （B-半乳糖甘酶）、lacY （透性酶）、lacA（乙酰基转移酶）得 以正常表达，启动转录。IPTG （异内基-B-D-1-硫代半乳糖甘）作为乳糖的类似 物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此IPTG经常作为lac操纵子 的诱导剂运用于筛选。. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS使用含有十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为琉基乙醇）的样品处理 液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸 3-5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质 变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。0IINa+ 0-SO-(C

37、H2)nCH3OSodium djdecyl sulHite(SDS)SDS变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。琉基乙醇打开二硫键以使蛋白质分子处于伸展状态。蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。加入SDS十二烷基磺酸钠)和少量琉基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。电泳过程中分子迁移的规律为：小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相 当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。四、实验材料.材料已得甘薯丫-GCS基因阳性重组子.试齐1J诱导表达LB培养基；SOC培养液；50 11 g/mL Am寓IPTG ;SDS-聚丙烯酰

38、胺凝胶电泳30%丙烯酰胺凝胶贮液：丙烯酰胺30 g, N, N-亚甲双丙烯酰胺g ;4x Tris Cl/SDS pH : g Tris 碱溶解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸调pH为后，定容至IJ 100 mL,再力口 g SDS;4x Tris Cl/SDS pH : g Tris 碱溶解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸 调pH为后，定容至ij 100 mL,再力口 g SDS;样品缓冲液：1 mL 4 x Tris Cl/SDS（pH , 1 g SDS, 2 mL 0-琉基乙醇，1mL峨酚兰，5 mL甘油，加蒸储水定容到50 mL;电极缓冲液：g Tris 碱，g甘氨酸

39、，g SDS;固定液：50刈酉I, 10%*醋酸；染色液：%（w/v）考马斯亮蓝R-250, 50酉I, 10麻醋酸；脱色液：7批醋酸，5刈醇；SDSLoading Buffer ；3、仪器电泳仪、染液缸五、实验方法. E. coli BL21 （DE3）感受态的制备;.重组子转化BL21;.原核表达1）挑取上述方法得到的单菌落于 2 mL LB液体培养基（氨苇青霉素50 g/mL） 中。同时，BL21作为对照（不加抗生素）。于37c培养至OD60M;2）取20仙L菌液接种2 mL LB液体培养基（氨苇青霉素50叱g/mL）, 37 C培养OD60的；3）加入IPTG最终浓度梯度2mM , 18C诱导表达16h;4）诱导结束后，用超声波破碎细胞；5） 1mL菌液加入 100pL 的 SDSLoading Buffer , 100c煮沸 5min；6）取30口上清样品点样，分析SDS-PAG胶，观察表达结果；4.按下表配方制备SDS胶，加样。先10 mAlS流电泳至分离胶，再调为15 mA恒流到电泳结束；组分12附离胶（mL）麻缩胶（mL）丙烯酰胺贮液4 X Tris Cl/SDS, pH4 X Tris Cl/SDS, pH ddH2O10%t硫酸俊TEMED5,考马斯亮蓝染色(1)将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定 2 h ；(2)倾去固定液，