多糖分离纯化

1、关于多糖分离纯化第一张，PPT共十九页，创作于2022年6月柱层析技术(chromatography) 柱层析技术(chromatography) 又称柱色谱技术，主要原理是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离开来。第二张，PPT共十九页，创作于2022年6月柱层析测定多糖分子分布量原理 多糖为单糖的天然聚合物, 多糖的性质和药理作用与其分子量大小, 分子量分布及其结构密切相关。多糖的分子量不是均一的, 具多分散性, 需要用统计方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝胶色谱法测定多糖的分子量及其分布, 具有快速, 重现性好等优点,在国内外得到了广泛的

2、应用第三张，PPT共十九页，创作于2022年6月案例分析：多花黄精多糖云芝多糖虫草多糖第四张，PPT共十九页，创作于2022年6月高效凝胶色谱法测定多花黄精多糖分子量与分子量分布 多花黄精多糖为水溶性多糖, 针对其单糖组成和空间结构与葡聚糖相似, 在色谱柱的选择上倾向于更适合于水溶性多糖分离测定用的Shodex OH Pak SB-803H Q 系列(对葡聚糖的排阻极限为1 105)第五张，PPT共十九页，创作于2022年6月操作流程1.色谱条件 色谱柱为Sho dex OH Pak SB-803HQ , 流动相为0.71 %硫酸钠溶液(内含0.02 %叠氮钠), 柱温:35 , 示差折光检测

3、器(检测器温度35 ), 流速0.5 ml min -1 , 取供试品溶液及对照品溶液各20l 注入液相色谱仪。2.标准曲线的制备及样品测定 取数个已知分子量的葡聚糖对照品，制成每1ml 中各含10 mg 的溶液作为对照品溶液，分别进样，由GPC 专用软件绘制标准曲线, 根据GPC 专用软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间采用GPC 专用软件计算样品各组分的重均分子量及其分子量分布。 供试品溶液配置：多花黄精多糖适量, 加流动相制成每1 ml 中约含10 mg 的溶液, 振摇, 室温放置过夜第六张，PPT共十九页，创作于2022年6月操作流程3.精密度试验 取同一供试品连续测定5次，表明该系统

4、测定样品分子量的精密度良好。4.重复性试验 取同一批号样品制作5份供试品分别测定，表明该分析方法测定样品分子量精密度良好。3.精密度试验取同一供试品连续测定5次，表明该系统测定样品分子量的精密度良好。第七张，PPT共十九页，创作于2022年6月操作流程5 稳定性实验 取同一供试品，在配置完成后不同时间段进样（0h 、2h 、4h 、8h 、12h.），表明供试品在配置后一定时间内稳定。6.样品测定 取不同批号的多花黄精多糖样品，制备供试品溶液，并进行分子量及分子量分布的测定。第八张，PPT共十九页，创作于2022年6月高效凝胶色谱法测定云芝多糖的分子量及其分布 云芝多糖能激活人体内巨噬细胞，从

5、而具有增强人体免疫功能的作用，临床上用于治疗慢性乙型肝炎、免疫功能低下等疾病。第九张，PPT共十九页，创作于2022年6月1. 云芝多糖的纯化 取云芝多糖原料约5 g，加水25 ml，微热振摇使溶饵，用Sevage法去蛋白，即加入等量氯仿一正丁醇(4：1)充分振摇，离心，弃下层凝胶样物，取上层溶液同法处理，直至下层溶液不再出现凝胶样物质。取上层溶液加入4倍体积的无水乙醇，振摇，离心，弃溶液，取沉淀物，加水10 ml振摇使溶解，再加入4倍体积的无水乙醇，振摇，离心，同法处理两次。取沉淀60C减压干燥4 h，取干燥物研细，备用。操作流程第十张，PPT共十九页，创作于2022年6月2. 色谱条件 色

6、谱柱：TSKGEL G3000PWxl，TSKGEL Gurad PWxl；流动相：005 molL Na2SOd (含005 NaN。)，流速：06 mlmin；检测器衰减：14，检测器温度25C(由RM6超级恒温水浴循环水控制)；数据采集时间：22 min。操作流程第十一张，PPT共十九页，创作于2022年6月3. 测定方法 取纯化后的样品以流动相制成10 mgml溶液，取右旋糖苷分子量对照品以流动相制成5 mgml溶液，分别用05 gm微孔滤膜过滤，各取20 l注入色谱仪。4.标准曲线 取重均分子量分别为200000、133800、84400、41100、21400、10000、4600

7、和2500 Da的右旋糖苷分子量对照品溶液进样测定，记录峰值保留时间，标定色谱柱。以保留时间对分子量的对数作线性回归，得回归方程。操作流程第十二张，PPT共十九页，创作于2022年6月虫草多糖的柱层析分离纯化 虫草多糖为白色粉末，无异味，易溶于水，虫草多糖是虫草体内含量最丰富、最重要的生物活性物质之一，具有诸多药理作用。第十三张，PPT共十九页，创作于2022年6月一、虫草多糖的柱层析分离纯化操作流程第十四张，PPT共十九页，创作于2022年6月操作流程第十五张，PPT共十九页，创作于2022年6月二、分部收集及多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法测定每管收集洗脱液的吸光值，绘制虫草多糖各柱层析过

8、程的虫草多糖洗脱曲线。根据洗脱曲线合并每个波峰相应波宽长度的洗脱管数，定容后测定多糖含量。操作流程第十六张，PPT共十九页，创作于2022年6月三. 标准曲线绘制 将葡聚糖标准品系列分别用流动相配成浓度为1.0mg/ml的标准样品液，进样量为20ul，采集色谱图，绘制曲线相关度较好的葡聚糖GPC校正曲线方程。 色谱条件：TSK-GEL G-5000 PW xl column（7.8mm 300mm）与TSK-GEL G-3000 PW xl column（7.8mm 300mm）串联；流动相0.02mol/L KH2PO4溶液，Ph6.0；流速0.6ml/min，柱温35，进样量20l操作流程第十七张，PPT共十九页，创作于2022年6月四.分子量测定 收集各多糖组分，经浓缩，透析，真空干燥后，用流动相配成浓度为1.0mg/ml的样液，高速离心（10000r/min，10min）后，取1.0ml上清液，过0.45um水相微孔滤膜，进样量为20ul，采集色谱图，根据上述所得葡聚糖 GPC校正曲