微生物限度课件

1、中国药典2010版微生物检验现状与展望胡昌勤中国药品生物制品检定所2010年5月26日 上海中国药典2010版微生物检验现状与展望1、中国药典2010年版微生物检验框架及特点 简要介绍中国药典2010年版微生物检验的基本特点。2、药品微生物检验的挑战和机遇 结合近年与微生物污染紧密相关的几件药害事件，分析当前药品微生物检查面临的问题与对策。3、微生物检验重点实验室建设规划与发展 药品微生物检验重点实验室建设的现实意义，以及在未来药品微生物检验、控制和监管中可能发挥的作用。阐述以微生物实验室分析技术平台为基础、加强生产过程微生物监控和监管为重点、改变我国医药产品微生物高风险现状的基本思路。药品质

2、量标准【性状】【鉴别】【检查】 无菌/微生物限度【含量测定】药品微生物检验概况药品质量体系可控性安全性有效性图1 药品质量体系构成与相互关系医药产品是人类与疾病斗争的工具。在世界各国的医药实践中，由于药品中污染微生物而引发的悲剧时有发生。药品微生物检验概况药品中污染的微生物通过微生物体及其分泌代谢产物导致机体过敏、中毒、感染等，严重的可以直接导致菌血症危及生命。此外，某些药品中污染微生物通过代谢活动改变药物组成、破坏有效成份而造成疗效改变或丧失。药品微生物检验概况所以，世界各国高度重视药品微生物检查，无菌/微生物限度检查均为各国药典中的重要内容。药品微生物检验概况我国开展药品无菌检查和微生物限

3、度检查已有数十年的历史。新中国第一部药典（1953年版）收载了无菌检查法。我国开展药品微生物限度检查始于1972年。1978年颁发了第一个“药品卫生标准”。药品微生物检验概况在中央和各地政府有关部门的关怀和重视下，经过我国药品微生物检验工作者几十年来的艰苦奋斗，我国药品微生物检验工作不断发展，标准不断完善，逐步建立起了符合我国国情的药品微生物检验标准体系。至2010版中国药典，我国药品无菌、微生物限度检查方法和标准在科学性、合理性以及与国际接轨方面均有了长足进展，使我国药品无菌和微生物限度检查步入了一个崭新的时期。药品微生物检验概况2006年78月发生了震惊全国的“欣弗事件”图2 夺命的欣弗图

4、1 死于欣弗的儿童2006年11月1日晚，肇事企业安徽华源生物药业有限公司原总经理裘祖贻，在公司办公室自杀身亡。据推测，其自杀原因可能是承受不了“欣弗欣弗”事件的重压。技术落后、标准化程度低；重要性被忽视、事故频繁！标准进步与标准化滞后的矛盾药品微生物检验现状药品微生物检验的机遇与挑战从“欣弗”到“刺五加”，频繁的不良事件，把药品微生物检验工作推到一个前所未有的关注高度，提供了发展的机遇；药品质量事故高发期，如何快速、准确地获得检验结果，又是对当前药品微生物检验工作的一个挑战。中心任务 把握机遇， 全面推进我国药品微生物检验工作； 迎接挑战， 在突发、应急检验中及时提供一个可靠的检验结论。建立

5、合理的药品微生物风险评价体系企业：PAT (Processing Analytical Technology)建立合理的上市药品监督抽验机制监督管理部门：以不良反应为先导的国家抽验计划建立完善的药品微生物检验和控制体系检验和质控部门：树立微生物检验新理念，检测实验微生物控制体系的认证与监管生产部门：生产工艺验证和执行监管 基本对策微生物检验与微生物控制的关系图2 药品微生物控制、微生物检验与参数放行微生物检验微生物控制参数放行中国药典2010年版框架2010年版中国药典已经编制完成，由中国医药科技出版社出版发行，2010年7月1日正式实施。2010年版中国药典是新中国成立60年来组织编制的第九

6、版药典，新版药典在总结历版药典的基础上，充分利用近年来国内外药品标准资源，注重创新与发展，实事求是地反映了我国医药产业和临床用药水平的发展现状，为进一步加强药品监督管理提供了强有力的技术支撑。 2010年版中国药典分为三部出版，一部为中药，二部为化学药，三部为生物制品。一、二、三部共同采用的附录分别在各部中予以收载，并尽可能做到统一协调、求同存异、体现特色。 中国药典2010年版框架2010年版中国药典关于微生物检查有以下主要特点：规定眼用制剂按无菌制剂要求，明确用于烧伤或严重创伤的外用剂型均按无菌要求。中药橡胶膏剂首次提出不得检出致病菌检查要求。新增抑菌效力检查法指导原则、药品微生物检验替代

7、方法验证指导原则、微生物限度检查法应用指导原则、药品微生物实验室规范指导原则等，以缩小附录在微生物方面与国外药典的差距。中国药典2010年版框架USP31-Chart10Microbiological TestsAntimicrobial Effectiveness TestingBiological Indicators-Resistance Performance TestsMicrobial Limit Tests()Sterility TestsMicrobiological Attributes of Nonsterile Pharmaceutical ProductApplicat

8、ion of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical ProductMicrobiological Evalution of Clean Rooms and Other Controlled EnvironmentsMicrobiological Best Laboratory PracticesValidation of Alternative Microbiological Methods中国药典2010年版无菌检查法微生物限度检查法灭菌法抑菌效力检查法指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则微生物限度检查法应用

9、指导原则药品微生物实验室规范指导原则中国药典2010版微生物检验标准的变化质量标准体系基本基本与国外接轨强调微生物检验的验证及过程控制对滴眼剂的质控水平大幅度提高部分品种特别是抗生素品种的无菌检查法由附录走入各论无菌检查法微生物限度检查法灭菌法抑菌效力检查法指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则微生物限度检查法应用指导原则药品微生物实验室规范指导原则如何建立我国的微生物检验质控体系！药品质量标准药品标准中的质控项目、分析方法和质控限度构成了药品标准的主体。质控项目、质控限度的合理性及检验方法的可操作性直接影响着质量标准的可执行性。质量标准的现状质控项目：目前抗生素药品标准的质控项目与国外标

10、准相比已经趋于一致。质控方法：通过与国外方法的比较确定国内的质控方法。质控限度：基本参照国外药典。建立适合于中国国情的微生物质控体系药品标准实验室建设2010版微生物检验方法增修订要点环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断药品微生物检验的关键点药品微生物实验室规范指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则微生物限度检查法指导原则无菌检查法中国药典与USP、BP方法的比较比较项目ChP2005USP29BP2002检验条件规定总体10000级、局部100级无具体规定无具体规定人员要求无具体规定正确培训和认可细菌检查培养基硫乙醇酸盐流体培养基

11、硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基真菌检查培养基改良马丁培养基大豆胰酪胨培养基 大豆胰酪胨培养基 培养基灵敏度检查与方法验证用菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌、黑曲霉检验方法只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法性状允许的样品均可采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除稀释剂与薄膜过滤冲洗液0.1蛋白胨水溶液；pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液供试品处理中的其他内容A、D、K0.1蛋白胨水溶液（ 0.1（聚乙氧基乙醇、0.1吐温-80）；十四烷酸异丙酯培养条件与时间14天（+2；3天）不少于14天（+不少于4天）14天（7天）结果判断与复试规定一次结果为准 (设备及环

12、境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试)微生物限度检查法中国药典与英美药典比较比较项目ChP2005USP29BP2002检验条件规定总体10000级、局部100级无具体规定无具体规定计数测定方法平皿法、薄膜过滤法、MPN平皿法、MPN平皿法、薄膜过滤法、MPN控制大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌、梭菌、其他致病菌大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金葡球菌、大肠菌群、肠道菌、肠杆菌科大肠埃希菌、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌；肠杆菌科及某些革兰阴性菌稀释液pH7

13、.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；pH6.8/7.6PBS；0.9%NaClpH7.2PBS；大豆酪蛋白消化培养基/乳糖肉汤培养基pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；乳糖肉汤/其他培养基培养条件与时间细菌数：营养琼脂，48hrs霉菌及酵母：玫瑰红钠琼脂，72hrs,57天需气菌总数：大豆酪蛋白消化物琼脂，4872hrs霉菌及酵母：沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂，57天需气菌总数：大豆酪蛋白消化物琼脂，5天霉菌及酵母：含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂、大豆酪蛋白消化物琼脂，5天控制菌检查结果判断与复试规定一次检出为准不符合标准规定，取大于25g的样品复试一次检出为准计数结果判断与复试规定第一次结果超过规定标准，复

14、试两次，三次结果平均报告不符合标准规定，取大于25g的样品复试测定结果在规定的限度标准5倍以内均为合格与国外药典的差异药典USP33/EP6.0中国药典2010分类依据按营养条件分按微生物类别分质控分类需气、厌气菌细菌、真菌检验体系直接与培养条件对应选择培养，或者人为区分评价简便、严谨难以操作硫乙醇酸盐流体培养基药典USP29EP-2001中国药典-2010名称Fluid Thioglycollate Medium硫乙醇酸盐流体培养基Fluid Thioglycollate Medium硫乙醇酸盐流体培养基Fluid Thioglycollate Medium硫乙醇酸盐流体培养基目的培养需氧、

15、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧微生物培养条件14天于30-35 C及20-25 C配方Pancreatic Digest of Casein(胰酪蛋白胨). .15.0 gYeast Extract(酵母浸出粉) . 5.0 gDextrose(葡萄糖). 5.5 gSodium Chloride(氯化钠). 2.5 gL-Cystine( L-胱氨酸) . 0.5 gSodium Thioglycollate (硫乙醇酸钠). 0.5 gAgar( 琼脂). 0.75 gResazurin( 刃天青). .1.0 mg大豆胰酪胨培

16、养基(TSB)与改良马丁培养基比较药典USP29EP-2001中国药典2010版名称Tryptic Soy Broth (Soybean casein digest medium)大豆胰酪胨培养基改良马丁培养基配方Pancreatic digest of Casein (胰酪蛋白胨).7.0gPapaic Digest of Soybean Meal.3.0gSoldium Chloride.5.0gDibasic Potassium Phosphate.2.5gDextrose monohydrate.2.5g蛋白胨.5.0g酵母浸出粉.2.0g葡萄糖.20.0g磷酸氢二钾.1.0g硫酸镁(

17、MgSO4.7H2O).0.5g目的支持广泛微生物的生长,包括需氧菌、专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是需氧菌）用于培养真菌培养条件14天于30-35 C及20-25 C14天于20-25 C样品编号细菌数（cfu/g）霉菌及酵母菌总数（cfu/g）普通营养琼脂TSA玫瑰红钠琼脂沙氏葡萄糖琼脂六味地黄丸156001160010102109010103110450010104101101010510101010微生物限度检查法培养基的比较普通营养琼脂,中国药典细菌计数培养基；TSA，国外药典细菌计数培养基。培养基体系的差异使得中国药典结果与国外药典结果之间不具有可比性。中国药典培养基体系的灵敏度较国

18、外药典低。药品微生物检验实验室需要解决哪些问题？是否有污染何种菌污染从那儿被污染结果判断-欣弗事件 编号鉴定结果0206L1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、粘质沙雷菌（S.marcescens）0206G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、粘质沙雷菌（S.marcescens）298L；298G1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2、粘质沙雷菌（S.marcescens）303L；303G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、阴沟肠杆菌（Enter.cloacae）305L；305G1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2、粘质沙

19、雷菌（S.marcescens）306L/6G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）307G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）308L（Al.faecalis）309L（Al.faecalis）304G嗜麦芽寡养单胞菌（S.maltophilia） 欣弗培养物洁净环境常见菌：头状葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）缓症链球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）藤黄微球菌（Micrococcusluteus）山羊葡萄球菌（Staphylococ

20、cuscaprae）肺炎克雷伯 巨大芽孢杆菌 粘质沙雷菌 夺命的欣弗结果判断-刺五加事件 云南样品BD鉴定菌株1016-9196-D-L-1Enterobacter cloacae 1016-9196-D-L-3Enterobacter cloacae1016-9196-D-L-4Enterobacter cloacae1016-9196-1Enterobacter cloacae1016-9196-2Enterobacter cloacae1016-9196-3Enterobacter cloacae1016-9196-4Enterobacter cloacae1016-TSA-9196-D

21、-L-1Enterobacter cloacae1016-TSA-9196-D-L-2Enterobacter cloacae1016-TSA-EDM-1Enterobacter cloacae1016-TSA-EDM-2Enterobacter cloacae9196-dEnterobacter cloacae培养物革兰氏染色 培养物革兰氏染色 直接涂片革兰氏染色 问题刺五加完达山样品BD鉴定菌株H3-SSI-1Enterobacter cloacaeH3-TSA-4-1Enterobacter cloacaeH6-TSA-3-1Enterobacter cloacaeH3-SSI-2Ent

22、erobacter cloacaeH3-TSA-4-2Enterobacter cloacaeH6-TSA-3-2Enterobacter cloacae脉冲场电泳分析 药品微生物检验重点实验室建设2009年4月23日中检所会同北京、天津、上海、黑龙江、江苏、浙江、广州、四川、总后等九家药检所的主管业务所长及微生物检验部门负责人在浙江省杭州市首次对药品检验所微生物检验重点实验室的建设问题开展研讨。 增强系统能力应对应急检验第一阶段：保证检验结果的准确可靠加强微生物实验室建设，建立FTIR细菌谱库，增加检验结果的可信度；建立应急检验SOP，提升实验室的快速检验能力；开展细菌的鉴别研究，实现对污染

23、菌的鉴别。第二阶段：实现对污染菌的溯源追踪开展分子生物学方面的工作：细菌基因物理图谱的分析（脉冲场电泳分析技术）16S RNA鉴别分析（RCP分析技术）形成能独立应对突发应急事件的能力微生物IR图谱测定基本步骤固体培养基划线培养取样并在水中制成均匀混悬液点样真空减压干燥制成菌膜液体培养基培养离心、盐水洗、水洗扫描图谱培养制样FT-IR分析 标 示 谱段(cm-1) 振动类型 代表的细胞组分 3000-2800 CH伸缩振动区 细胞膜脂肪酸 1800-1500 酰氨（、）区 细胞蛋白和肽类，DNA、RNA结构 1500-1200 混合区 蛋白质和脂肪酸，磷酯 1500-1400 二级脂肪酸区 两

24、性细胞质膜成分（蛋白质和类脂） 1200-900 C-O伸缩振动区 细胞壁多聚糖 900-700 指纹区 长链脂肪酸不同来源的阴沟肠杆菌的FT-IR一阶导数光谱（1180-900cm-1）的比较蓝色来自实验室无菌阳性样品中的分离菌 绿色其它来源的无菌阳性样品中的分离菌 中检所判断药品污染的方案定期采集环境菌FTIR图谱测定外环境菌谱库内环境菌谱库药品微生物检测FTIR图谱测定相似不相似药品污染实验环境污染相似不相似操作失误进一步比较重试药品微生物实验环境微生物的监测药品的微生物检测环境细菌与药品细菌的比较结论保证药品微生物检验结果可靠的有效途径药品微生物实验室的现状具有微生物检验资质的人员注：

25、上海1上海所抗生素室微生物实验室；上海2上海所生检室微生物实验室。硕士包含在职研究生及已取得学位人员。总人数（人）按职称分按学历分主任药师副主任药师主管药师药师药士高级工程师博士硕士本科其它黑龙江103133/127/北京5113/上海19/1215/351上海25/1121/311江苏74人从事日常检验，09年拟招2名微生物专业硕士浙江9/12/四川8/341/35/总后6主任药师以上本科以上广州52/41天津6/321无菌室微生物实验室面积(无菌室+其他)无菌室面积无菌微生物限度阳性操作间验证实验室BLS-2其他 面积黑龙江160502间1间1间/110北京/1001间2间1间 / 61间/ 20/95上海1/4间1间120上海2/68331间/江苏501间 / 101间 / 101间/浙江200601间2间1间140四川/451间 / 121间 / 121间 / 6/总后514间1间/ 31广州140/2间1间1间/天津381间 / 271间 / 111间 / 6注：上海1上海所抗生素室微生物实验室；上海2上海所生检室微生物实验室。实验室设备配置1注：上海1上海所抗生素室微生物实验室；上海