《医学实验动物学》03第三章微生物与寄生虫质量控制课件

1、第三章 实验动物微生物学和寄生虫学及其质量控制第1页，共89页。 第2页，共89页。第一节实验动物防疫的基本概念第二节 实验动物微生物学和寄生虫学等级分类第三节、第四节 合格动物群中常见微生物和寄生虫污染及其影响第五节 实验动物微生物学和寄生虫学质量检测 第3页，共89页。传染源传播途径易感动物第一节 实验动物防疫的基本概念一、实验动物传染病流行的基本环节 第4页，共89页。传染源（1）人源性（2）动物源性引起传染的条件（1）要有病原性和一定的毒力 （2）侵入体内的病原体要达到一定的数量 （3） 病原体要有适当的侵入门户第5页，共89页。传播途径切断传播途径是控制传染病的主要措施。 （1）、直

2、接传染：健康动物与患病动物（包括携带病原体动物）直接接触而感染。如狂犬病病毒、猴B病毒、艾滋病病毒等。 水平传播：实验动物群体中互相的传播。传播途径包括消化道、呼吸道或皮肤粘膜创伤等。如沙门氏菌常经消化道感染；仙台病毒常经呼吸道；布氏杆菌病常由配种直接感染等。 垂直传播：由母体通过胎盘将病原体传给胎儿，例如支原体、细小病毒等。第6页，共89页。间接传播（一）非生物性传播：a、经空气飞沫、尘埃传播；b、以饲料、垫料传播；c、经饮水和饮水用具传播；d、经笼器具传播。（二）生物性传播：a、节肢动物：苍蝇、蚊子、蟑螂、蚤、虱、蜱、螨等。 b、野生动物：野生啮齿类动物，常携带各种病原体，例如携带流行性出

3、血热病毒的野鼠的尿污染实验动物的垫料、饲料。c、实验动物：从外部新购入的实验动物，未经严格检疫和隔离。d、饲养、实验人员不注意卫生防疫传染病原体；有些人兽共患病，也可经人传播给实验动物，例如结核、布氏杆菌病等。第7页，共89页。易感动物1）种类（品种） 2）年龄 3）营养状况 4）机体的抵抗力5）机体防御器官状况第8页，共89页。 在医学和兽医学研究领域，疫苗接种和药物治疗是预防传染病的有效手段。 但是实验动物一般不采取疫苗接种和药物治疗，主要由于实验动物的特殊性： 1、应用疫苗或治疗制剂可能干扰实验结果。 2、经过治疗或免疫的动物，外表健康，但可能 是带菌或带毒者，可能成为潜在的传染源。 3

4、、对于小型实验动物，治疗措施可能在经济上 不合算第9页，共89页。实验动物卫生防疫主要包括以下几个方面的内容： 1、平时的预防措施 2、发生疫病时的扑灭措施 3、消毒措施 4、隔离措施第10页，共89页。第二节 实验动物微生物学 和寄生虫学等级分类第11页，共89页。一、普通动物 conventional animal(CV) 必须是不携带主要人兽共患病原体和动物烈性传染病的病原体。第12页，共89页。 饲育在开放环境里,使用的垫料和饲料,只消毒不灭菌;其饮水须符合城市饮用水标准。 普通动物只能用于教学实验和某些科研工作的预实验。第13页，共89页。 二、清洁动物 Clean animal(C

5、N),亦称最少疾病动物 , Minimal Disease animal(MD)。必须是不携带主要人兽共患病原体和动物烈性传染病的病原体，又不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体。第14页，共89页。 清洁动物通常来自屏障环境的SPF动物的后代或降级；饲育在屏障环境中；饲育所用的垫料，饲料，饮水和用具等均应经过高压蒸汽消毒。工作人员需穿无菌服装才能进行饲育或实验操作。 第15页，共89页。三、无特定病原体动物SPF 不携带主要人兽共患病原体和动物烈性传染病的病原体；又不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体；还不携带主要潜在感染或条件致病菌和对科学实验干扰大的病原体的动物。第16页，

6、共89页。 SPF动物的饲育通常是:先培育出无菌动物或悉生动物;然后,再将其后代转移到屏障环境内饲育繁殖建群。第17页，共89页。 四、无菌动物germ free animal(GF) 动物体内外无可检出的一切生命体的动物。此种动物在自然界中并不存在,必须用人为的方法培育。 第18页，共89页。无菌动物的取得和饲育环境子宫摘除术（剖腹产）饲育在隔离环境（隔离器内）一切用品经过严格包装、严格灭菌后，通过传递仓送入隔离器通过手套进行间接实验操作第19页，共89页。五、悉生动物 (GnotobioticAnimals,GN )动物体内外所携带的生命体是已知的。此种动物原是无菌动物，系人为的将指定微生

7、物丛定居其体内外。第20页，共89页。GF、GN和SPF隔离环境GF动物植入GN动物污染GF动物 植入污染屏障环境SPF动物第21页，共89页。实验动物微生物学分类模拟图人兽共患病原体动物传染病原体影响实验微生物所有微生物已知微生物 普通级动物 清洁级动物 SPF级动物无菌动物 悉生动物第22页，共89页。不同微生物学等级的实验动物比较项 目GFSPFCV传 染 病无无有或可能有寄 生 虫无很少有或可能有实 验 结 果准确较准确有疑问应 用 动 物 数少量少量多或大量长期实验效果可能好可能好困难死 亡 率很低低高长期实验存活率约100约9040左右实验标准设计可能可能不可能统 计 价 值很好较

8、好不准确实验结果的价值很高高有疑问第23页，共89页。实验动物微生物学标准国家或国际组织动 物应排除病毒项目ICLAS小鼠/大鼠14/9中国小鼠/大鼠5+6/7芬兰小鼠/大鼠16/8日本小鼠/大鼠8/9美国小鼠/大鼠（9）10/8澳大利亚小鼠/大鼠13/8荷兰小鼠/大鼠11/10第24页，共89页。实验动物微生物学标准国家或国际组织动 物细菌真菌支原体ICLAS小鼠/大鼠13/12中国小鼠/大鼠8+8/9+7芬兰小鼠/大鼠11+9/10+9日本小鼠/大鼠10/10美国小鼠/大鼠（16）13/12澳大利亚小鼠/大鼠12/12荷兰小鼠/大鼠7/18第25页，共89页。第三节 实验动物群中常见微生物

9、和寄生虫污染及其控制一.普通级合格动物中弓形虫污染 弓形虫是一种人畜共患的寄生虫，小鼠，大鼠，地鼠，豚鼠，家兔和非人灵长类实验动物及猫，牛，羊，猪等都能感染。第26页，共89页。 弓形虫是细胞内寄生虫，根据不同发育阶段分为五型：滋养体和包囊出现在中间宿主体内，裂殖体，配子体和卵囊只出现在终宿主猫体内。第27页，共89页。滋养体排出体外,发育成熟,具感染性卵 囊口,鼻,咽,呼吸道粘膜,眼结膜和皮肤机 体有免 适疫 宜 发 育宿主体内无性繁殖,引起发病急性力 条无 件症 下 终宿主 受 精 宿主产生 状 免疫力 感 染 肠绒毛上皮 细胞内发育包 囊裂殖体合 子雌雄配子体滋养体经猫消化道侵入肠上皮细

10、胞发育繁殖第28页，共89页。 弓形虫感染可引起肠粘膜和肠系膜淋巴，心、眼、肾上腺、脾、脑、肺、肝、胎盘及肌肉组织的坏死和损伤。 在病畜和带虫者的肉、内脏、血液、渗出液和排泄物中均有弓形虫，甚至从乳中也能分离出弓形虫，也可引起感染。第29页，共89页。弓形虫污染的预防 实验动物设施内要保持清洁，定期消毒，严格阻断猫及其排泄物对设施、饲料、垫料和饮水的污染。尽一切可能消灭野鼠。第30页，共89页。二.清洁级合格动物中的仙台病毒和小鼠肝炎病毒的污染第31页，共89页。 仙台病毒属于副粘病毒科,副粘病毒属,与人类HA2病毒同被归入副流感病毒型,它们之间有密切的抗原关系。 现在认为:啮齿类实验动物是仙

11、台病毒唯一自然宿主。 第32页，共89页。 仙台病毒除了鼻内途径外，其它途径均不引起小鼠的自然感染。 偶尔可在肾、肝、脾、等器官发现病毒，但在尿、血和肠内则没有病毒。第33页，共89页。 不同品系小鼠对仙台病毒感染的易感性和敏感性明显不同。在自发性流行中抵抗力大的小鼠如SJL/j等死亡率接近0，高度易感小鼠如Swiss裸鼠则可接近100。感染的裸鼠其疾病症状出现的时间比有免疫机能的小鼠稍晚，并伴有进行性消瘦。在较长的时间里陆续死亡。第34页，共89页。 普通级鼠群中仙台病毒感染是最难控制的病毒感染之一凡新引进的动物必须经8周检疫(检查引入动物和“哨兵”动物的病毒抗体)。一旦在屏障环境内的鼠群中

12、检出仙台病毒抗体阳性，若不及时清除所有被感染动物，将导致屏障设施的失败。第35页，共89页。两种方法 1.消灭已感染鼠群,重引符合标准的种鼠或用无菌技术剖腹取胎重建繁殖群。2.暂停繁殖，在相对静止条件下保存这种非繁殖群直至感染消除(约2个月)，然后恢复繁殖。第36页，共89页。小鼠肝炎病毒(MHV) 属冠状病毒科，冠状病毒属，与人冠状病毒 (普通感冒可有肺炎)，大鼠冠状病毒 (新生大鼠肺炎)，大鼠唾液腺病毒(唾液腺，泪腺炎)同属。有多种毒株。第37页，共89页。 消瘦型肝炎病毒是实验小鼠最重要的病毒感染之一。呈世界范围性分布，无明显的季节性差异。多数情况下是亚临床感染或慢性感染。临床表现为肝炎

13、，脑炎和肠炎。 急性发病的临床症状：被毛粗乱，小鼠倦怠，营养不良，脱水，体重减轻。同笼老鼠挤做一团，肌肉震颤，尿色变深，针刺时不愿移动等。老龄老鼠倾向于发生脱水和消瘦。第38页，共89页。 MHV传播方式有经空气和接触两种。 小鼠是唯一能自然感染MHV;通过脑内接种,可实验感染小鼠,大鼠和地鼠,但兔和豚鼠无反应。第39页，共89页。 MHV是普通级实验小鼠难以清除的病毒之一。唯有对小鼠进行胚胎移植术、剖腹取胎术,结合屏障环境内维持饲养,才能培育无MHV感染的清洁级以上小鼠。必须注意MHV垂直传播的可能性。第40页，共89页。 通过定期检测,有利及时发现屏障环境内的鼠群中鼠肝炎病毒感染。及时消灭

14、被感染的鼠群。 重新引进符合标准的种群。 同步交配代乳方法重建繁殖群。 用胚胎移植、无菌剖腹重建繁殖群。 暂停繁殖方法重建繁殖群。第41页，共89页。 还可采用同步交配,把MHV阳性鼠群中怀孕母鼠自然分娩的新生鼠在分娩后的24小时内传给符合标准的代乳鼠带乳。然后在代乳鼠3周龄,6周龄和12周龄进行血清学检测,可获MHV阴性小鼠。第42页，共89页。 暂停繁殖法：从感染群中移去所有新生鼠,离乳鼠和妊娠鼠。停止繁殖15周,可排除感染。 15周后出生的第一代新生在34周龄MHV血清阳性,四周后因从母方获得的抗体衰退而血清阴性。 在第二代小鼠39周龄MHV血清阴性。 第43页，共89页。三.SPF级实

15、验动物中的细菌污染 1.绿脓杆菌2.金黄色葡萄球菌3.肺炎克雷伯氏杆菌第44页，共89页。 绿脓杆菌是动物和人类胃肠道的一种常在菌。实验动物可经口咽和胃肠途径感染；常可在小鼠的口咽部和肠道发现。 第45页，共89页。 该菌可导致远交群小鼠(Swiss-Webster)和近交系小鼠(C3H)斜颈和转圈症状，被看作是小鼠疾患的主要细菌病原。对免疫环境遭受损害或抑制的宿主，绿脓杆菌可穿过局部淋巴环境和血管环境，导致致死性败血症。 第46页，共89页。 因正常人皮肤中也可携带绿脓杆菌,由屏障环境内的工作人员带入屏障环境。 在常规小鼠群的饮水器中能检到绿脓杆菌。 在温暖、潮湿的环境中(如SPF小鼠饲养室

16、的淋浴更衣处)也常检到这种菌。第47页，共89页。 要预防或绿脓杆菌,就必须定期对SPF小鼠进行微生物学监测，及时淘汰被感染的鼠群。 通过酸化(用盐酸调整PH2.5)氯化(10ppm)饮水来预防饮水器对SPF小鼠的感染; 对屏障环境的淋浴更衣室常规进行彻底打扫消毒灭菌并要求进入屏障环境的工作人员严格执行操作规程和个人防护用品的穿戴。第48页，共89页。金黄色葡萄球菌 在小鼠皮肤和粘膜上，常检到致病的金黄色葡萄球菌和一般不致病的表皮葡萄球菌。虽然金黄色葡萄球菌还没有被广泛看作实验小鼠的原发性疾病，但有些文献中报道了其作为皮肤感染，淋巴感染或粘膜感染病原学因子。第49页，共89页。 小鼠自发性葡萄

17、球菌感染与小鼠品系，营养及屏障环境的操作管理有关。幼鼠比成鼠易感。无胸腺裸小鼠因缺少保护性被毛并缺乏T细胞而经常发生皮肤和眼窝的葡萄球菌感染。第50页，共89页。 据对SPF设施的细菌学监测发现，从健康SPF小鼠分离的金黄色葡萄球菌的噬菌体型常与从动物管理员体表分离的品系一致。 从有临床症状的感染动物最常分离到的凝固酶阳性葡萄球菌的培养和噬菌体型也能从动物管理员那儿分离到。第51页，共89页。 通常不能治疗或根除金黄色葡萄球菌； 饲养人员和实验人员严格执行隔离措施和操作细则； 唯有通过定期检测及时淘汰患鼠；酸化饮水；饲料和垫料彻底灭菌；经常更换垫料。 第52页，共89页。克雷伯氏菌 人和动物的

18、肠道常在菌，是与人和动物泌尿，呼吸道感染有关的条件性致病菌。 小鼠自发爆发的疾病临床症状是：食欲不振，弓背，被毛粗乱，打喷嚏及呼吸深快。第53页，共89页。 为了从受感染的小鼠中清除这种病原体，就需要进行剖腹产和严格的屏障环境。第54页，共89页。第五节 实验动物微生物学和寄生虫学质量检测一.检测目的二.检测方法三.检测规则第55页，共89页。一、检测目的第56页，共89页。1.排除人兽共患病，确保从事实验动物生产的饲养人员和动物实验的科研或教学人员身体健康。第57页，共89页。2.排除危害实验动物的常见病多发病，确保实验动物种群的健康，为生命科学研究提供合格的实验动物。第58页，共89页。1

19、对新引进的普通级动物进行检疫，防止人兽共患病原体或动物烈性传染病带入实验动物种群，或传播给实验人员。2定期对生产繁殖的实验动物种群进行抽样检测，及时了解实验动物生产群体中微生物学和寄生虫学质量；必要时作出淘汰或降级处理。第59页，共89页。3当实验动物种群发生传染病流行时，检出感染途径，提出控制或预防措施。4对实验动物生产或实验设施进行静态和动态检测，及时掌握实验动物环境条件，了解是否符合实验动物国家标准。第60页，共89页。 3. 研究确定实验动物微生物学和寄生虫学等级标准的划分，和不同等级实验动物的微生物学和寄生虫学质量指标。第61页，共89页。4.确保使用实验动物的药品和生物制品的质量，

20、保证进行动物实验的科学研究成果和各种动物试验结果的可靠性、准确性和重复性。第62页，共89页。二. 检测方法第63页，共89页。方法要求：1.国内外通用,比较成熟,便于交流。2.可操作性强，检测结果易判断，检测率较高。3.易实现标准化和规范化，便于推广。第64页，共89页。国家推荐性标准实验动物微生物学检测方法14GB/T14926.114926.642001实验动物寄生虫学检测方法GB/T18448.118448.102001 第65页，共89页。1. 实验动物病毒学检测方法 目前我国对实验动物病毒学检测通常使用血清学方法，包括：酶联免疫吸附试验（ ELISA ）免疫荧光试验（ IFA）免疫

21、酶染色试验（ IEA ）血球凝集（HA）和血球凝集抑制（HI）试验第66页，共89页。2. 实验动物细菌学检测方法 通常采用细菌分离和培养方法。根据培养基上菌落特征，将分离到的可疑菌落作生化鉴定。第67页，共89页。 检测人员的实际工作经验，直接影响到其对检测结果的判断准确性。对部分细菌，如沙门氏菌，支原体等已开展血清学方法检测。泰泽氏病原体不能在人工培养基上生长，目前还以病变组织压片镜检进行检测，并结合病理学检查结果作出判断。 第68页，共89页。3. 实验动物寄生虫学检测方法 通常在光学显微镜下查找寄生虫的虫体、虫卵或孢子。对人兽共患的弓形虫，则采用各种血清学的方法进行检测。第69页，共8

22、9页。三.检测规则1.检测频率 拟以间隔23个月为宜。在实验动物的国家标准中，即规定：每3个月至少检测1次。第70页，共89页。 病原体刚侵入实验动物群体时,较易分离到病原体;而当流行趋于平静可能分离不到病原体,但特异性抗体的检出率上升。通常在23个月内，抗体检出率不会下降太大。随着时间的推移，某些个体的抗体效价水平会下降，以及新生的非感染动物增加，使抗体阳性动物的检出大量减少。第71页，共89页。2.取样数量 通常对于动物群体中感染率高的病原体，只需少量采样就能检出；而当感染动物比例低时，若不增加取样数量，就可能漏检。 因此，可根据实验动物群体中病原体的感染率决定取样数量。如病原体感染率为1

23、，要检出感染动物至少应取样100只。第72页，共89页。病原体检测取样数量感染率 % 检测可信度99959090221803227043260543507544096530139720 21141110442922第73页，共89页。 达标的实验动物须排除的病原体感染率应为“0”,取样数量须达60-90%以上，其检测结果的可信度方可达到95-99%。而啮齿类实验动物采样，通常都牺牲被检测动物; 且实验动物寄生虫学质量检测通常与微生物学质量检测同时进行，而病原体的感染率不可能相同。因此,在标准中采用的取样数量和取样方法，将适当参考实验动物群体大小，兼顾绝大多数病原体的感染率，以决定取样数量;并规

24、定取样点。 第74页，共89页。实验动物不同生产群体取样数群体规模，只取样数量，只51005001050020每只隔离器检测2只第75页，共89页。活体取样 对实验动物的活体取样未作规定。 无特殊要求时，对鸡、兔、犬和猴的活体取样，可在生产繁殖设施内进行。第76页，共89页。第十章生物安全第77页，共89页。一、生物安全的定义 针对生物医学专业或现代生物技术的开发和应用，造成对人体健康和生态环境的潜在威胁，而应采取的一系列有效预防和控制的措施。第78页，共89页。广义的生物安全包括(1)人类的健康与安全;(2)人类赖以生存的农业生物的安全;(3)与人类生存息息相关的生物多样性，即环境生物安全。

25、第79页，共89页。生物危害主要来自： 1.野生动物所感染的各种微生物 2.不合格实验动物所携带的各种人兽共患病的病原体第80页，共89页。野生动物所感染的各种微生物 生物危害 实验人员或饲养人员环境的污染 生态环境、生物多样性存在着潜在着威胁不合格实验动物所携带的各种人兽共患病的病原体第81页，共89页。忽视生物安全的行为 1.午餐与标本同存于实验室冰箱内； 2.在实验室内抽烟、进食、喝饮料； 3.不戴手套清洗未消毒的玻璃器皿； 4.穿着实验服去食堂午餐、到会场开会；第82页，共89页。 5.随意使用来源不清，质量不明的动物进行实验； 6.生物垃圾与生活垃圾混淆一起处理； 7.坚持使用传统的超净工作台，不添置生物安全柜；第83页，共89页。超净工作台级生物安全柜级生物安全柜超净台与生物安全柜第84页，共89页。WHO对感染性微生物分类标准等级危险度传播结果对人和城乡社会的危险度低。不可能引起人类疾病，或引起兽医学上重要动物疾病的微生物。对人有中等危险度，对城乡社会有轻微危险性。对人或动物虽有致病性，但对实验室工作人员，对社会、家畜、环境等不会造成重大灾害的病原体。在实验室内接触可能发生严重感染，但有有效的防治方法，传播可能性不大。对人危险度高，对城乡危险性低。人感染了会引起重症疾病，但传播给其他人的可能性低对人和地区社会有高度危险性能引起人或动物的重症疾病，患