PCR不只是温度循环课件

1、PCR基本原理变性退火延伸N个循环第1页，共82页。PCR的基本成分模板DNA特异性引物热稳定DNA聚合酶脱氧核苷三磷酸（dNTP）二价阳离子（Mg2+/Mn2+）缓冲液（Tris-Cl）一价阳离子（KCl）2第2页，共82页。原理简单，结果多变重复性差假阳性假阴性扩增效率低Ct值出现的晚标准曲线线性不佳WHY?第3页，共82页。组分量很重要相互制约的平衡之道4Mg2+TaqKCl引物模板产物dNTPEDTA腐殖质盐离子盐离子模板引物复合物活性构象螯合螯合螯合BufferDDTTween甘油第4页，共82页。反应温度时间很重要动态竞争的过程引物与引物，引物与模板的不同部位都会有一定的结合力，只

2、是大小有差异，取决于温度与浓度DNA聚合酶与引物，与双链DNA（模板和产物），与模板引物复合体都能结合，只是与后者结合力更强DNA聚合酶与DNA的结合是动态的，在不断的结合与分离DNA分子之间的结合，以及聚合酶与DNA分子之间的结合发生的温度范围很广，并非只有退火的时候才发生。温度和时间决定了哪个产物能胜出第5页，共82页。原理简单，控制不易成分控制体积控制温度控制时间控制6第6页，共82页。成分控制核酸抽提试剂引物合成可能有杂质商品化的PCR试剂盒未标明成分7第7页，共82页。体积控制移液器吸头操作手法8第8页，共82页。温度及时间控制 滞后效应9金属底座散热器耗材导热膜反应试剂半导体温度探

3、头第9页，共82页。面对困难如何调整优化10试剂仪器耗材人模板序列模板引物二级结构GC含量完整度抑制剂二聚体错配让厂商去优化吧第10页，共82页。荧光定量PCR（QPCR）是咋回事？PCR全部循环跑完再检测一次产物量，在电泳仪上分离后，用EB等染料染色，在紫外灯下检测。通过荧光分子标记，QPCR每跑一个循环都检测一次产物量，无需任何分离，在QPCR仪内直接检测。一个PCR反应产物检测只得到一个数据，只能粗略判断终产物的量。一个单色QPCR跑40个循环可以检测到40个数据，可以更精确的推断出DNA的量。第11页，共82页。荧光分子简介荧光是一种光致冷发光现象。荧光分子经某种波长的入射光（通常是紫

4、外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出出射光（通常波长比入射光的的波长长，在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。12荧光分子的性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、黏度等改变而灵敏地改变。第12页，共82页。非特异性荧光染料：1、 SYBR Green 特异性荧光探针： 2、TaqMan（Taqman-MGB) 3、Molecular Beacon 4、LNA probes 5、Scorpions primers 6、FRET probe 7、Allglo探针 8、蝎形引物

5、（Scorpion primer）：荧光标记引物 9、Amplifluor：荧光标记引物QPCR用什么荧光分子，怎么用？SYBR Green，FAM，HEX，VIC，TET，JOE，CY3，TAMRA，NED，ROX，CY5，LC-Red等等第13页，共82页。 实时荧光定量PCR 方法 1 SYBR Green 法(EVA Green)Excites at 497 nm and emits at 520 nm.第14页，共82页。SYBR Green 染料工作原理 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开

6、，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发 荧光，在此阶段采集荧光信号。第15页，共82页。SYBR Green 法 优缺点 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNA 使用方便 -不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜优 点 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高缺 点第16页，共82页。实时荧光定量PCR方法2TaqMan法TaqMan-水解型杂交探针与目标序列互补 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光

7、能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针第17页，共82页。实时荧光定量PCR方法2TaqMan-MGB法TaqMan-水解型杂交探针荧光素非荧光淬灭基团与目标序列互补MGB(Minor Groove Binder)将探针的Tm值提高10因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。第18页，共82页。 TaqMan法 工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光第19页，共82页。Taq

8、man法 优缺点对目标序列的高特异性-阴性结果确定设计相对简单-与目标序列某一区域互补重复性比较好优 点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高设计及实验难度大不易找到本底低的探针缺 点第20页，共82页。SYBR Green 法PCR反应的建立反应体系的建立及优化:避免非特异产品SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer 体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同EVA Green、LC Green第2

9、1页，共82页。SYBR Green 法 应用范围 起始模板的测定 基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物。HRM第22页，共82页。TaqMan 法 PCR反应的建立1、引物、探针的设计：探针优先于引物 有软件可以辅助设计：Primer5、beacon design、Primer Express 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定（使用梯度功能） 一般为：94 ，10-20S

10、60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同第23页，共82页。Taqman法 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析第24页，共82页。实时荧光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分子信标)环茎荧光素 淬灭剂标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成发夹型杂交探针第25页，共82页。Molecular

11、 beacon (分子信标)工作原理探针游离时，呈发夹结构，不能检测到荧光互补序列出现时，探针与DNA结合，探针转变成开放的线性结构，产生可被检测的荧光。第26页，共82页。Molecular beacon (分子信标) 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析第27页，共82页。Molecular beacon (分子信标) 优缺点高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优 点 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高缺 点第28页，共82页。实时荧光定量PCR 其他方法LNA probes- Locked Nucleic Acids碳

12、环引入亚甲基桥，提高Tm的作用Scorpions primers 第29页，共82页。实时荧光定量PCR 其他方法FRET probeAllglo探针蝎形引物（Scorpion primer）：荧光标记引物Amplifluor：荧光标记引物其他第30页，共82页。QPCR能定什么东西的量，怎么定？绝对定量：用已知量的标准品做标准曲线，推算未知的样本中基因的拷贝数或浓度。相对定量：样本中目标序列相对于另一参照样本的量的变化。常用于比较样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比。SNP基因分析其他31第31页，共82页。实时荧光定量PCR 原理 扩增曲线荧光基团荧光检测元件扩增曲线图： 横坐

13、标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集第32页，共82页。一个极具重现性的参数Ct值Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性第33页，共82页。什么是Ct值，如何确定？Cycle of thresholdPCR反应管中的荧光信号达到特定值（threshold，阈值）时候的所需要的循环数。不同的数据分析方法（样点拟合法/基线阈值法，最大二阶导数法）得到的Ct值不同，一般选用前者。34第34页，共82页。 实时荧光定量PCR 原理Ct值Ct值的定义-样点拟合法（基线阈值法）： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定

14、的域值时所经过的扩增循环次数C(t) value 第35页，共82页。实时荧光定量PCR 原理荧光阈值荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值第36页，共82页。 实时荧光定量PCR 原理Ct值Ct值的定义-最大二阶导数法： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号变化最大时所经过的扩增循环次

15、数。重复性好，但对曲线要求高。第37页，共82页。确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量25有了Ct值，怎么定量？绝对定量第38页，共82页。实时荧光定量PCR法-标准样品绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA和体外转录的RNA（假病毒） 用于生成标准曲线的样品如何设定？1.含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒或cDNA2.紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度3.根据

16、质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释第39页，共82页。相对定量相对定量中的内标（看家基因）内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量Ct, Ct法目的基因、看家基因对比样本、待测样本第40页，共82页。科研中的应用：核酸浓度定量环境微生物的监测转基因植物中外源基因的检测基因转录的检测第41页，共82页。医学中的应用：对病原DNA的检测染色体病的诊断基因病的诊断药效考核肿瘤研究第42页，共82页。影响定量PCR结果的因素起始材料模板DNAPCR扩增荧光检测数据处理结果分析核酸抽

17、提，反转试剂人为操作影响仪器，耗材，试剂软件第43页，共82页。仪器之间的差异44第44页，共82页。仪器因素不同品牌的仪器之间有什么区别加热（不同半导体之间的差异）导热（底座材料的差异）散热（散热片的材质，形状，大小，风扇的大小，转速，寿命）功率升降温的速度，策略电源，电流电压的稳定性光学信号检测的实现方式不同第45页，共82页。软件差异数据处理算法不一样分析方法不一样第46页，共82页。实验参数的影响温度循环参数的影响荧光增益值的影响背景校准参数的影响第47页，共82页。不同品牌试剂之间的差异酶的活性（扩增效率不一样）荧光分子质量（发光强度不一样）组分不同（适用的模板不一样，扩增效率不一样

18、）纯度优化程度第48页，共82页。不同耗材之间的差异板生产厂家的模具精度，稳定性，批间差（影响加热或荧光采集）适应的机型不一样膜透明度（影响荧光信号采集）稳定性，耐热性，粘度（液体蒸发）移液器枪头模具精度不够，气密性不一致（影响加样一致性）第49页，共82页。常见的一些96孔PCR板50第50页，共82页。模板的影响起始材料的质量核酸抽提方案的选择抽提试剂的选择反转录试剂的选择第51页，共82页。人的因素加样的准确性样品是否混匀膜是否封的严实第52页，共82页。多因素影响的烦恼dNTP，Buffer，酶，引物，模板，H2O，Mg2+仪器，软件，电脑，板材，管，膜移液器，枪头第53页，共82页。

19、行业标准缺乏给用户增添了大量麻烦耗材和仪器不兼容试剂在某个机型上效果不好试剂和耗材配合不好各种产品品种繁多，生产厂家繁多厂家只管自己的产品达到好的效果，很难考虑下游实验的效果54第54页，共82页。PCR，不只是温度循环！55用户要考虑的东西太多了！第55页，共82页。一揽子解决方案56试剂仪器耗材来自同一个厂商的产品会做好各种兼容性测试，保证了实验效果用户不再是小白鼠第56页，共82页。一揽子解决方案的便利省时省力省钱把时间和精力花在科学问题上早出结果，早发文章出好结果，发大文章57第57页，共82页。良好的习惯试剂摆放前后一致的加样方式时刻观察各个试剂组分的配置浓度要合适第58页，共82页

20、。良好的实验环境59第59页，共82页。标准PCR实验室布局图三区分隔布局-加强防污染第60页，共82页。良好的实验环境PCR操作柜第61页，共82页。气溶胶污染的案例药厂学校第62页，共82页。仪器使用及维护定量PCR价值高，人人都要使用维护困难定量PCR是一种高精密的电子机械产品机器内有电子元器件也有机械运动部件有精密的温控系统和光学系统怎样的使用和维护才能保证仪器的使用寿命及检测结果的准确性？第63页，共82页。仪器使用及维护仪器放置对环境的要求防水防尘洁净空间防电磁干扰周围不能有大型设备防电网波动-使用UPS避光不能放在有光线变化的环境下通风给仪器一定的生存空间电脑专用的电脑、防病毒第

21、64页，共82页。仪器使用及维护仪器使用的要求仪器安装必须按照使用说明书进行升降温速度最高速度与平均速度极限温度能不用就不用开机时间使用结束后及时关机，保护光电系统使用高质量的定量PCR管（必须是底部透明）第65页，共82页。仪器使用及维护仪器实验做不出来的可能原因机器坏了试剂坏了操作失误模板坏了仪器间差异环境的差异第66页，共82页。仪器使用及维护仪器维护的要求仪器的清洁防污染模块的清洁减小本底差异长期不用定期用可靠的试剂做仪器性能测试（均一性检测），如果差异偏大就要咨询厂家第67页，共82页。第68页，共82页。占地面积 26，000 M2拥有一万级的净空房、大型超净实验室、GMP试剂车间

22、、中心实验室等一流的环境和设备。建筑面积 16，000 M2第69页，共82页。中国最大的生命科学仪器生产厂家亚洲最大的PCR仪专业生产基地A REMARKABLE SUCCESS STORY让我们从这里 开启一段博日之旅博日科技第70页，共82页。有 序专 注严 格博日制造公司概况公司概况科学仪器制造第71页，共82页。产品策划产品设计产品调试产品验证研 发公司概况公司概况第72页，共82页。 公司简介 07 BIOLOGICAL PIONEER制造优势GMP标准车间1800平方米的GMP标准车间第73页，共82页。严格按照国际先进的质量保证体系运行通过德国TUV的ISO9001和EN46001认证公司概况公司概况品质保证第74页，共82页。公司概况1992瞩目过去，放眼未来！20121995年 成立 Ferrotec中国集团研发小组1995全球最大的半导体制冷片生产基地！中国 杭州公司概况发展背景2002年 杭州博日科技有限公司正式成立2002第75页，共82页。76 公司概况公司概况发展背景 2015 立志成为中国生命科学领域的先锋初期市场探索阶段公司品牌初创阶段 199519972000200120082010Ferrotec（中国）研发小组成立博日科技成立涉