分子细胞生物学(复习)

1、细胞信号转导细胞信号传递概述细胞通讯（Cell communication ） 一个细胞发生的信息通过介质（又称配体）传递到另一个细胞并与靶细胞相应的受体相互作用，然后通过细胞信号转导产生胞内一系列生理变化，最终表现细胞整体的生物学效应的过程。 细胞信号转导是实现细胞间实现通讯的关键过程，它对多细胞生物细胞间功能的协调、控制细胞的生长和分裂、组织发生与形态建成时必须的。细胞通讯方式分泌化学信号的通讯内分泌旁分泌自分泌通过化学突触传递神经信号细胞间接触依赖性的通讯（细胞间直接接触，通过与质膜结合的信号分子影响其他细胞）间隙连接实现代谢耦联或电耦联信号转导系统及其特征具有信号识别的特异性，放大作用

2、和信号终止、下调，细胞对信号的整合作用。细胞内信号蛋白的相互作用细胞内信号蛋白的相互作用是靠蛋白质模式结构域所特异性介导的。信号分子与受体信号分子 物理信号化学信号：激素、局部介质、神经递质各种化学信号根据其溶解性通常分为两类：亲脂性信号分子：甾类激素、甲状腺素亲水性信号分子：神经递质、局部介质、大多数肽类激素（生长因子、细胞因子、内分泌激素）气体NO受体：是一种能识别和选择性结合某种配体的大分子，主要为蛋白质，多为糖蛋白，少数为糖脂。 根据靶细胞上受体的存在位置，可将受体分为：细胞内受体 位于细胞质基质或核基质中，主要识别结合小的脂溶性信号分子，为胞外亲脂性信号分子所激活。细胞表面受体 识别

3、和结合亲水性信号分子；根据信号转导机制和受体蛋白类型不同，分为：离子通道耦联受体G蛋白耦联受体酶联受体（受体酪氨酸激酶、细胞因子类受体超家族、受体丝/苏氨酸蛋白激酶）免疫球蛋白超家族TNF或NGF类受体家族非受体酪氨酸激酶受体对信号系统的调节受体数量的调节向下调节：数量减少向上调节：数量增加机制：受体合成或分解速度变化； 膜受体介导的内吞与受体的再循环； 受体的位移或活性部位的暴露受体亲和力的调节：受体磷酸化与去磷酸化控制信号转导蛋白活性的方式： 通过配体的调节;通过G蛋白调节；通过可逆磷酸化调节第二信使学说： 胞外化学物质（第一信使）不能进入细胞，它作用于细胞表面受体，而导致产生胞内第二信使

4、，从而激发一系列生化反应，最后产生一定的生理效应，第二信使的降解使其信号作用终止。分子开关：细胞转导过程中通过结合GTP和水解GTP或通过蛋白质磷酸化与去磷酸化而开启或关闭蛋白质的活性。第二节 细胞信号转导通路细胞内受体介导的信号转导细胞内受体超家族的本质是依赖激素激活的基因调控蛋白。在细胞内，受体与抑制性蛋白结合形成复合物，处于非活化状态；当信号分子与受体结合，将导致抑制性蛋白从复合物上解离下来，使受体通过暴露它的DNA结合位点而被激活。类固醇激素诱导的基因活化通常分为两个阶段：直接激活少数特殊基因转录的初级反应阶段，快速反应；初级反应的基因产物再活化其他基因产生延迟的刺激反应，对初级反应起

5、放大作用。NO作为气体信号分子进入靶细胞直接与酶反应NO由一氧化氮酶（NOS）催化合成后扩散到邻近细胞，与鸟苷酸环化酶活性中心结合，改变酶的构象，导致酶的活性增强和cGMP合成的增多，cGMP作为第二信使介导蛋白质的磷酸化过程，发挥多种生物学作用。第三节 G蛋白耦联受体介导的信号转导G蛋白耦联受体的结构与激活 G蛋白耦联受体，指配体-受体复合物与靶蛋白的作用要通过G蛋白的耦联，在细胞内产生第二信使，从而将胞外信号跨膜传递到胞内影响细胞的行为。 G蛋白是三聚体GTP结合调节蛋白的简称，位于质膜胞浆一侧，有G、G、G亚基组成，G和G亚基以异二聚体存在，G和G亚基分别通过共价结合脂分子锚定于膜上，G

6、本身具有GTPase活性，是分子开关蛋白。 当配体与受体结合，三聚体G蛋白解离，并发生GDP与GTP的交换，游离的G-GTP处于活化的开启状态，导致结合并激活效应器蛋白，从而传导信号； 当G-GTP水解成G-GDP时，则处于失活的关闭状态，终止信号传递并导致三聚体G蛋白的重新组装，系统恢复进入静息状态。G蛋白耦联受体介导的细胞信号通路以cAMP为第二信使的信号通路磷脂酰肌醇双信使信号通路G蛋白耦联离子通道的信号通路G蛋白耦联受体介导离子通道的调控信号途径特点：1.受体/离子通道复合体,四次/六次跨膜蛋白 2.跨膜信号转导无需中间步骤,又称配体门离子通道 3.主要存在于神经细胞或其他可兴奋细胞间

7、的突触信号传递 4.有选择性:配体的特异性选择和运输离子的选择性如乙酰胆碱激活的通道,只运输Na+和Ca+,-氨基丁酸激活通道只运输Cl-乙酰胆碱-N受体（260KD）外周型：5个亚基组成调节主要为亚基变化通道开启：Na+内流，K+外流，膜去极化。注释：M-型乙酰胆碱受体（乙酰胆碱的结合引发Gi亚基的活化并与G解离，k+通道开放，引起质膜超极化）3、Gt蛋白耦联的光受体的活化诱导cGMP-门控阳离子通道的关闭（图8-25）p245G蛋白与视紫红质（光受体）耦联，称之为传导素（transductin，Gt）4.3酶连受体介导的信号传递一、受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kin

8、ases, RTKs）包括6个亚族信号传导：配体受体受体二聚化受体的自磷酸化激活RTK胞内信号蛋白启动信号传导RTK-Ras-Raf信号途径RTK-PL3K-AKT信号途径（1）、配体与受体在胞外与受体结合并引发构象改变，因此配体的结合导致受体二聚化；（2）、当受体二聚化后，激活受体的蛋白酪氨酸激酶活性；（3）、活化的PTKs可结合带有SH2结构域的结合蛋白或信号蛋白。SH2SH3首先在Src蛋白中发现,所以称作Src同源区(Src homolog region 2 and 3, SH2, SH3)SH2选择结合在磷酸酪氨酸残基，SH3选择结合在富含脯氨酸基序（motif）（4）在GEF作用下

9、，无活性的Ras-GDP变成有活性的Ras-GTPRTK-Ras信号通路配体RTKadaptorRasRaf（MAPKKK）丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MAPKKMAPK有丝分裂原活化蛋白激酶（mito genactivated化修protein kinase）进入细胞核其他激酶或基因调控蛋白（转录因子）的磷酸化。RTKGNRPRASRAFMEKERKTranscription factortranscriptionRTK-PL3K-ATK信号途径G蛋白耦联受体介导的MAPK的激活(1) MAPK(Mitogen-activated protein kinase)又称ERK（extracelular

10、 signal-gulated kinase）真核细胞广泛存在的Ser/Thr蛋白激酶.(2)MAPK的底物:膜蛋白(受体、酶)、膜浆蛋白、核骨架蛋白、及多种核内或胞浆内的转录调控因子在细胞增殖和分化中具有重要调控作用。(3)PKC、PLC与G蛋白耦联受体介导的MAPK激活(4)G蛋白耦联受体激活G蛋白：G蛋白亚基或亚基激活PLC：PKC通过Ras或Raf激活MAPK：(5)PKA对G蛋白耦联受体-MAPK途径的负调控(6)cAMP，MAPK：cAMP直接激活cAMP依赖的PKA：PKA可能通过RTK或通过抑制Raf-Ras相互作用起负调控作用。4.4其他信号途径NF-B信号转导途径旁激素信号

11、转导途径（又称生长分化因子（growth and differentiation factor, GDF）,由诱导细胞产生，并通过扩散的方式到达邻近的靶细胞）Hedgehog信号途径Wnt PathwayNotch信号转导途径二、细胞对信号的控制靶细胞对信号分子的5种脱敏方式：受体没收：受体-配体复合物内吞受体下调：反应减弱（迟发相）受体失活：受体磷酸化：受体与Gs解耦联，cAMP反应停止并被PDE降解信号蛋白失活产生抑制蛋白细胞周期调控内容提要细胞周期的概念细胞周期的驱动因子（cyclin and CDK）细胞周期的抑制因子（p21、p27、p15、p16、）细胞周期调控机制G1期、G2-S

12、、S期、M期(G2-M，中期)细胞周期的基本概念细胞增殖周期通常简称细胞周期（cell cycle），是指细胞从上一次细胞分裂结束到本次分裂终了的过程或间隔时间。根据细胞周期不同时相的特点，可将细胞周期顺序分为4个连续阶段，即G1期(gap phase 1)、S期（synthesis phase）、G2期（gap phase 2）及M 期（mitotic phase）.1、1细胞周期的4个阶段及其与G0期的关系1、2早期胚胎细胞的细胞周期早期胚胎细胞周期主要指受精卵在卵裂过程中的细胞周期。由于卵细胞在成熟过程中已经积累了大量的物质基础，基本可以满足早期胚胎发育的需要 ，因此早期胚胎细胞周期的G

13、1和G2期非常短，以至认为其仅含有S期和M期。非洲爪蟾精卵前12个细胞周期共需8h，而其体细胞的细胞周期持续时间约24h。第一节 细胞周期的驱动力量cyclinhe CDK的磷酸化和去磷酸化细胞周期的程序控制主要通过各种细胞周期蛋白（cyclin）和依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin dependent kinase， CDK）有序的磷酸化和去磷酸化从而控制cyclin-CDK复合物的活性来实现的。在各个阶段还可以分别处理来自细胞内外的各种信息并作出相应的应答。组成这一自动程控机器的成分还有细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibit

14、or， CDI）、磷脂酶和泛素（ubiquitin）哺乳动物细胞周期不同周期蛋白的表达时期不同，与不同的CDK结合，调节不同CDK激酶的活性。部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK激酶活性的关系。细胞受丝裂原刺激后合成cyclin的时序和相对浓度2、2 CDK家族CDK是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，目前发现有9种成员，有不同程度的同源性，故称CDK家族，各成员命名为CDK1，2，39.CDK含催化亚基，但需要cyclin提供调节亚基才有活性。通常以cyclin-CDK复合物形式出现。CDK的上游尚有CDK活化激酶（CDK-activating kinase，CAK）。CD

15、K也能与CDI结合，而抑制细胞周期。此外，CDK 自身的磷酸化状态与其活性也密切相关，如CDK 中的苏氨酸（T）残基和酪氨酸（Y）残基磷酸化，可使CDK激活，而活化的Thr残基发生去磷酸化则使CDK失活。CDK1 CDK1又称cdc2.cdc（cell division cycle gene）.这些基因在进化上高度保守，如酵母的cdc2与人的踩单车28结构类似，编码产物是相对分子质量为34000的蛋白质，一般表示为p34cdc2/cdc28。P34对G1/S转换和G2/M转换都是必需的.P34与cyclin B结合成的复合物是成熟促进因子(MPF)的重要组分,对驱动细胞进入M期至关重要.199

16、1年冷泉港(cold spring harbor)实验室发起的一次细胞周期研讨会上决定把cdc2命名为CDK家族的第一号,即CDK1.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDI）CDI（yclin dependent kinase inhibitor）是CDK的抑制物,通过与CDK非共价结合而抑制CDK活性的，是与cyclin-CDK作用相对抗的重要机制之一，参与细胞周期检查机制。哺乳动物细胞的才CDI主要包括Ink4、Kip及GADD45等。Ink4(inhibitor 偶发CDK4的缩写)是一族CDK4的特异性抑制蛋白,只特异性抑制CDK4、CDK6.第一个被坚定的成员为p16，其他成员有p1

17、5、p18及p19.Kip即kinase inhibition protein 的缩写，包括p21、p27及p57.P21的功能在G1期p21抑制cyclinD-CDK4、cyclin A-CDK2及cyclinE-CDK2，pRb不能发生磷酸化，细胞停滞于G1期，利于细胞进行修复。但p21对cyclinB组成的复合物的抑制活性较弱。P21与p27有协同作用。通过与PCNA结合使PCNA不能与DNA聚合酶形成复合物，或使DNA全酶复合物不能在模版DNA单链上滑动，影响DNA的复制。在细胞应激时，p21通过抑制应激激活蛋白酶（stress-activated protein kinase, SA

18、PK）的活性，认为p21参与细胞应激状态时的信号转导。p21蛋白的功能区域示意图功能:主要在G1和G1-S期的转变阶段抑制cyclin-CDK活性 通过与PCNA结合影响DNA的“复制” 通过抑制SAPK参与应激时的信号转导调节：p53依赖途径（p53作为转录因子启动p21表达） 非p53依赖途径（佛波脂、吖啶橙等可诱导p53-/-人类拜细胞株的p21表达。3、3内源性增殖抑制因子抑制因子是细胞中产生的，具有组织特异性的，抑制生长的调节分子，作用于细胞本身。有人称其为“抑素”。具有以下性质：（1）无论在体内或体外，均能抑制有丝分裂，具有组织特异性（2）无种间差异（3）制造抑素的组织即是该抑素作

19、用的靶组织（4）对有丝分裂的作用是可逆的，对细胞无损害作用3、4蛋白磷酸酶蛋白磷酸化与脱磷酸化几乎设计所有生理过程:从胚胎发育到细胞的生长发育、分裂分化、基因表达甚至癌变等。它是使cyclin-CDK的靶分子去磷酸化的酶，其作用与cyclin-CDK相反。例如蛋白磷酸酶I（PPI），它在M期使Rb蛋白发生去磷酸化。PP2A主要在G2/M 相过渡和M 期的终止时参与一系列磷酸化的过程,组织细胞进入有丝分裂期。3、5泛素为中介的蛋白水解体系Cyclin的浓度依细胞周期而变化，其产生取决于mRNA的转录与蛋白质的合成，其降解则需要蛋白水解体系，这种水解是以泛素为中介的。泛素是高度保守的小分子蛋白。C

20、yclin被分解时，先在一种特定的连接酶作用下，泛素链接到cyclin分子特定的位点，然后由依赖泛素的蛋白水解酶的作用，将cyclin连同泛素一起水解掉。G1周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有破坏框，C端有一段PEST序列与其降解有关。4、CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸），参与细胞的多种功能）4、1 G1期G0期与G1期早期交界处有一个检查点，决定细胞是停留在静止状态，还是从G0期进入G1期这一检查点，通常称之为限制点（estriction point）.G1晚期与S期交界处（表示为G1/S交界处）也有一个检查点，负责检查染色体DNA是否有损伤，如DNA有损伤，

21、则要求细胞先进行修复，然后才能复制，以免遗传信息传递出错。细胞在通过G1晚期检查点之前一直对各种刺激（生长因子、丝裂原、分化诱导剂等）敏感。细胞周期调控概况G1晚期检查点决定是否进入S期，这最终取决于外界环境能否提供增殖信号及细胞内部有无出现障碍。去除丝裂原后，许多分化的哺乳动物细胞可以从细胞周期退出进入G0期；也有一些细胞停滞于G1期，然后发生凋亡，换句话说，G1期细胞的命运取决于外部信号能否诱导G1期细胞合成D型cyclin等主要调控蛋白。离子射线可诱导细胞增加表达p53，后者可诱导p21和GADD45表达增强，从而使细胞阻滞于G1后期。P53突变的细胞经DNA损伤剂处理后，不能休止在G1

22、期，经导入野生型p53，细胞再用电离辐射处理后则变为休止在G1期。可见p53是在G1/S期执行DNA损伤检查的关键蛋白.p53与染色体的稳定性有关.G1/S期交界调控示意图p27阈值设定者（threshold setter）在G0期，细胞内含有较高而相对恒定浓度的p27而缺少CDK,随着从休止状态借方出来，细胞开始合成cyclin和CDK，并积累cyclin CDK复合物，但它们大多因被p27所结合而失活。当细胞内cyclin CDK复合物增加到某一临界值后，可将p27完全结合，此时，细胞内游离的cyclin CDK复合物开始积累，细胞周期向S期推进。4、2 S期S期的主要任务是进行DNA复制

23、与修复,在每一条染色体的DNA分子上,有3种特异的核苷酸序列是复制所必需的,它们是多个复制起点（replication orgin）、1个着丝粒（centromere）和2个端粒（telomere）.真核细胞DNA复制是多点起始、双向复制的，不仅要启动DNA复制而且要关闭复制，以确保每段DNA在一个细胞周期中只复制一次，即S期DNA复制的起始存在“开启”和“关闭”机制。S期的cyclin/CDKS期初期主要发生cyclinE和A激活CDK2,两者都是启动DNA复制子所必需的。继cyclinE激活CDK2后不久，发生cyclinA激活CDK2，且与可测定出的DNA合成同步。G1晚期阻滞细胞可表达

24、一定水平的cyclinE，但不表达cydinA。CyclinA的过高表达足可克服S期阻滞。S期的CDI主要为p21.DNA损伤可诱导p21表达，p21可抑制所有已发现的cyclin-CDK复合物。在S期p21抑制PCNA参与DNA的复制与修复。DNA复制的开启与关闭DNA复制的起始特殊序列，称为复制子（replicator），复制子是否开启，决定于复制子与启动有关的DNA结合蛋白组装成复制复合物（replication complex，RC）及其状态。起始识别复合物（orgin recognization complex，ORC）ORC由6种多肽组成；自主复制序列（autonomously r

25、eplicating sequence，ARS）与DNA复制起始有关，它与蛋白质结合。ORC突变可使细胞阻滞于S期。极可能cdc28可直接激活ORC。CyclinE CDK2或cyclinA CDK2与ORC-ARS呈怎样的关机，目前不完全清楚。CDC6是其中的一个调节因子，在G1期CDC6含量瞬间提高，CDC6结合在ORC上，在ATP供能下，促进6个亚单位构成的MC符合体和其他一些蛋白结合到ORC上，形成前复制复合体（pre-replicative complex, pre-RC）,MCM实际上就是DNA解旋酶（hellicase）。S-CDK触发pre-RC的启动，同时阻止了DNA再次进行

26、复制，因为S-CDK将CDC6磷酸化，使其脱离ORC，磷酸化的CDC6随后被SCF参与的泛素化途径降解；S-CDK还可以将某些MCM磷酸化，使其被输出细胞核。其他一些CDK也参与阻止pre-RC的再次形成，从而保证了DNA的复制当且仅当一次。The mechanisms cotrolling S-phase initiation in animal cellsThe Rb protein acts as a brake in mammalian G1 cellsThe control of G1 progression and S-phase initiation is often disru

27、pted in cancer cells, Ieading to unrestrained cell-cycle and cell proliferation.PRb及其相关蛋白G1期CDK的主要作用底物是pRb或pRb的相关蛋白.Rb基因首先从视网膜母细胞癌(retinoblastoma)中鉴定出来，是一种肿瘤抑制基因。Rb基因失活可促进肿瘤的发生发展。CyclinD CDK可使pRb磷酸化。非磷酸化的pRb能结合转录因子E2F使之处于失活状态，从而阻止细胞周期的推进。E2FE2F是一类细胞转录活化因子，因首先发现它可激活腺病毒E2启动子而得名。已发现E2F有5个成员，即E2F-15.E2F

28、通常以与其他蛋白质形成复合物的形式存在 ,只有少数细胞株(如Hela细胞)含有大量游离形式的E2F。许多DNA合成基因和细胞生长控制基因的启动子中都存在E2F的结合位点，E2F可直接活化这些基因，启动DNA合成，从而使细胞进入S期。4、3 M期（1）MPF的激活P34与cyclinB结合及p34的磷酸化是MPF活化的关键步骤.p34的T161磷酸化受CAK(cdc2-activating Kinase)催化完成.PP2A可使磷酸化的T161去磷酸化,从而抑制p34的活性.T161磷酸化使p34处于一种特殊空间构象,适合与cyclinB结合.当p34与cyclinB结合后空间结构发生变化,使T1

29、4 Y15残基暴露出来,M期之前weel-mikl关联蛋白使之磷酸化,此时cyclinB-p34没有活性.进入M期，cdc25将P34-T14-Y15磷酸基移去，于是MPF激活。M期的检查点G2/M期检查点G2期检查点负责检查DNA复制是否完成.DNA复制未完成,则可激活weel-mikl蛋白激酶.weel-mikl可使p34的T14-Y15发生磷酸化，MPF失活，细胞阻滞于G2期；DNA复制已完成，则cdc25表达出cdc25蛋白（p54/80）,使上的磷酸基被水解掉,MPF呈现活性,细胞进入M期.4、4 M中期末的检查点M中期末的检查点是指cyclinB灭活机制.其中APC活性变化是认识细

30、胞由分裂中期向分裂后期转化的关键问题之一。APC各成分在分裂期间中表达，但只有到达M期之后才表现出活性，提示M期CDK活性对APC的活性起着调节作用。APC活性受到纺锤体装配检查点的监控，纺锤体装配不完全或所有动粒不能被动粒微管捕捉，APC不能激活。（1995年KING在非洲爪蟾卵种分离出了一种20S的蛋白复合体，称之为APC（后期促进因子）。在E1、E2、泛素和ATP再生体系存在的情况下，APC可以在体外将cyclinA、B降解）染色体分离及纺锤体组装检控点的分子机制在染色体的移动依赖于纺锤体微管蛋白结合在着丝点上的运动。参与该监测点最重要的2类基因是MAD和BUB。MAD2和BUB1存在于

31、尚未结合微管的动粒上，这两种蛋白在着丝点上可以探测动力与微管的结合。Control of proteolysis: APC regulates exit from Mitosis by Proteolysis of M-Cdk(cdk1/cdc2). The spindle-attachment checkpoint: Unattached chromosomes block sister-chromatod separation. The sister chromatid seperation is triggered by protein.小结：细胞周期及其调控可简单地比喻为一个高度自动化

32、的机器。该机器主要由动力系统和制动系统2个部分组成，两者相互协调、相互制约，才能保证有丝分裂的正常进行。其动力系统一旦启动，可使细胞周期依编好的程序 ，按时间有序地一步一步进行下去。有人称之为“细胞周期时钟”（cell cycle clock）细胞对外界信号作出反应，通过细胞内信号系统，激活细胞周期的动力系统，通过有序地活化各种cyclinCDK复合物和磷酸酶，诱导一连串的级联式反应，通过对转录因子及其他功能蛋白的磷酸化和去磷酸化，实现各种细胞期的功能，细胞周期有精密的检查机制，在各细胞期之间转化时都有检查点和检查机制，从而确保程序进行的正确性这个自动化机器运转失灵，就可能造成细胞衰老，死亡或

33、恶化。细胞分化第一节 细胞分化的概念发育细胞分化基因选择性表达蛋白/DNA相互作用信号网络胞外信号 衰老 组织器官 细胞周期细胞分化细胞凋亡 染色质 细胞分化 组织器官 细胞凋亡 细胞增殖细胞分化 细胞衰老 不对称分裂干细胞(组织干细胞) 细胞分化 干细胞 分化细胞 去分化(重编程) 转分化?第二节 细胞分化的分子基础细胞分化(cell differentiation):在个体发育中,由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态结构和功能上形成稳定性差异,产生各不相同的细胞类群的过程细胞分化是多细胞生物发育的基础与核心;细胞分化的关键在于特异性蛋白质组成；合成特异性蛋白质实质在于组织特异性基因在

34、时间和空间上的差异性表达；差异性表达的机制是由于基因表达的组合调控。细胞癌变是正常细胞分化机制失控的表现。细胞分化是基因选择性表达的结果：细胞分化主要是奢侈基因中某些特定基因的选择性表达基因表达可在三层水平上进行调控：基因水平，转录水平，翻译水平1.1 基因表达的调控DNA的甲基化：哺乳动物失活的X染色体在生殖细胞形成时才重新恢复活性状态雌性哺乳动物中一条X染色体保持缄默：巴氏小体DNA重排：淋巴细胞合成不同的抗体马蛔虫染色质消减体细胞的前体细胞在很早的卵裂阶段中经历染色质消减，约占80%以上的DNA被丢失，因此不再具备完整的基因组，所以仅有生殖系的细胞具有一套完整的基因组结构。1.2转录水平

35、的基因调控转录过程包括转录的起始，延伸和终止。这一过程的调控最为复杂，包括RNA聚合酶的选择、启动子的选择、终止信号的识别等。RNA聚合酶的选择识别正确的起点和终点1.3转录后加工的调节1.4翻译水平的调控细胞质中进行的转译水平的调控包括mRNA稳定性的控制、差别翻译、翻译起始的控制、下游区的控制等。铁蛋白的翻译是细胞在mRNA水平控制基因表达的一个很好的例子。卵母细胞中mRNA的翻译调控机制mRNA masking：mRNA与其他蛋白质结合成ribonucleoprotein（RNP）complex，阻止与ribosome结合；卵成熟或受精后，离子强度改变或蛋白磷酸化等导致mRNA解体，翻译

36、得意进行。5 Cap(7-甲基鸟苷酸)的调控,如某些种类的moths,其卵中的部分mRNA的5-鸟苷酸在受精后才甲基化,然后开始翻译.mRNA sequester:指mRNA被阻隔于蛋白合成装置,如海胆未受精卵的histone mRNA定位于原核中,受精后原核破裂,mRNA才能进入胞质开始翻译。翻译效率的调控：如将海胆卵细胞裂解液的pH从自然状态下的pH6.9提高到（受精后自然状态下的）pH7.4，蛋白质合成量急剧增加。受精后pH升高的作用可能包括去除mRNA的封闭蛋白和激活翻译起始因子。1.5 翻译后水平上的调控Activation by cleaving some domains,e.g,

37、 proinsulin(胰岛素原)Activation by removing protecting proteins,e.g., Dorsal;Control of functions by subcellular localization, e.g., membrane proteins;Assembly with other proteins, e.g., hemoglobin;Activation by binding to ions, e.g., calmodulin;Activation by modification, e.g., phosphorylation3.1细胞的全能性

38、（totipotency）概念：细胞全能性是指细胞经分裂和分化后仍具有产生完整有机体的潜能或特性。植物细胞具有全能性，在适宜的条件下可培育成正常的植株动物细胞核移植（nuclear transfer）实验证明细胞核具有发育全能性3.2影响细胞分化的因素受精卵细胞质的不均一性对细胞分化的影响细胞间的相互作用与位置效应细胞记忆与决定 果蝇成虫盘（imaginal disc）环境对性别决定的影响3.2.1细胞质中含有影响分化的遗传因子基因组是发育信息的重要的载体，但细胞质中也同样含有这样的信息。启动一个动物受精卵形成胚胎所需要的信息渔村在卵子发生期的卵母细胞里母体效应（maternal-effect

39、）卵母细胞中贮存的mRNA和蛋白的分布是不均匀的，各种mRNA在细胞中都有定位分布，并随卵裂进入不同的子细胞中。DNA（核）-mRNA-Protein（细胞核）3.2.2胚胎诱导（embryonic induction）（图，蛙眼发育的诱导实验）动物在一定的胚胎发育时期，一部分细胞影响相邻细胞使其向一定方向分化的作用称为胚胎诱导，或称为分化诱导。3.2.4环境对性别决定的影响爬行类依赖程温度的性别决定：在大多数龟类和所有的鳄鱼种的性别是由受精后的环境决定的。在一些龟类中：如果卵在28以下孵化，所有孵化的龟将为雌性，在32以上，每个卵产生的是雄性。主要缺陷：可能是物种存活的温度限制。有人假设恐龙

40、可能已经具有依赖温度的性别决定，温度的变化使它们的卵只能孵化出雄性或雌性，以致它们突然消亡。4.1干细胞的特征干细胞是具多潜能具自稳定性，自稳定性是其区别于肿瘤细胞的本质特征增殖速度较缓慢干细胞能无线的增殖分裂干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态干细胞通过两种方式生长，一种是对称分裂形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。干细胞内部，以及外部与其生境细胞间有特定的信号传导通路，调节自我更新

41、和分化。 4.2胚胎干细胞（ES cell）胚胎干细胞（ES）是指从早期胚胎的卵裂球、囊胚细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培养建成的称胚胎生殖细胞,简称EG细胞。它们统称胚胎性干细胞4.2.1ES和EG细胞系基本特性体外能无线增殖假使在培养条件合适时，ES细胞可以在体外无限增殖。但实际上，传代次数越多，ES细胞会像常规细胞一样，出现核型不正常的情况，并失去了ES细胞原有的一些重要特性体外产生分化细胞1981-2003，这2类胚胎干细胞所分化的细胞都是体细胞2003-2004，证明体外培养的ES细胞能产生雌、雄两性的生殖细胞，实现了体外培养的ES细胞也能表达“安全性”概念，这

42、是ES细胞体外定向诱导分化的一个重大突破。体内产生畸胎瘤ES和EG细胞若接种于免疫缺损小鼠腋窝等下，可形成由内胚层、中胚层、外胚层多种细胞构成的畸胎瘤。巢状生长有多能胚胎干细胞分子标记染色体数目和核型正常经体外传代培养后具有正常的染色体数目和二倍体核型，即使冻存苏后仍然保持这种特性遗传可操作性由于ES细胞在体外可以不断自我增殖，又具有发育的全能或多能性，并能通过构建嵌合体产生有功能的生殖细胞。这为通过基因工程途径改造物种提供了独特的、无与伦比的受体细胞。形成嵌合体实现种系传递4.2.2胚胎干细胞的鉴定首先要鉴定是否保持正常的核型通过胚胎期特异表面抗原来监测巢素蛋白（nestin）阳性胚胎干细胞

43、碱性磷酸酶活性高，分化的细胞较低人和小鼠都表达转录因子Oct-4端粒酶活性极高，而分化的细胞则很低体外诱导分化，可以分化为三胚层的不同细胞谱系体内移植至裸鼠腋下，形成的瘤体应包含多种类型4.2.3 ES细胞分化潜能的监测将ES细胞给同源动物或裸鼠皮下注射会形成复杂的混合组织瘤 瘤组织包括胃上皮（内胚层）；骨和软骨组织、平滑肌、横纹肌（中胚层）；神经表皮、神经节和复层鳞状上皮（外胚层）；说明ES可分化为三个胚层形成胚状体（拟胚体）：ES在体外合适的培养条件下，部分能形成胚状体。嵌合体实验：将ES与正常胚胎嵌合；（人不能形成嵌合体，伦理学原因）嵌合胚：说明早期卵裂球有同等的发育潜力。自然人群中也出

44、现过同时有XX型和YY型细胞的人。胚胎干细胞：保持了分化为胚胎本体的潜能的、可在体外增殖的胚胎细胞。在基因功能研究和疾病治疗方面有重要的作用。4.2.4 胚胎干细胞的分化能力胚胎干细胞能分化成为体内全部200多种细胞。但其应用于临床尚需解决定向分化和致瘤性两大难题。全能干细胞：能分化成所有的细胞类型（ES,EG）多能干细胞：能分化为某一类组织中的所有细胞类型（造血干细胞，神经干细胞）4.3 成体干细胞是指一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新潜能并负有构建和补充某组织的各种类型细胞的干细胞，故又称组织干细胞。在正常生理条件下 ，倾向于分化成并更新所在组织的各种细胞。但在特定的外界条件下

45、，一种组织的成体干细胞能够超越该特定组织、胚层分化成其他组织的功能性细胞，补充参与其他组织损伤的修复等。成体干细胞造血干细胞，神经干细胞，胰腺干细胞，肝脏干细胞，肌肉干细胞。造血干细胞的特征：形态：类似小淋巴细胞表面标志：CD34+、CD38-、Lin-、HLA-、DR+、Thy+、CD45RA-、CD71-其中CD34+是临床应用最多的造血干细胞标志物。HSC的鉴定将分离的细胞植入致死量照射的小鼠体内或SCID鼠体内，可长期重建多谱系造血血细胞的形成与更新：胚胎发育期，血细胞发生于中胚层的血岛。鸡血岛位于胚盘外侧覆盖在卵黄囊上的胚外中胚层上，人类的也是在相应部位覆盖，在卵黄囊上的中胚层上发现

46、的。此后，干细胞迁移到肝脏、脾脏，也可能到达胸腺。最后，它们在骨髓中增殖。出生后的哺乳动物，干细胞只占骨髓中总体细胞的0.01%，它们是提供所有细胞的唯一来源。造血干细胞的定义和分类：定义：多向分化：能分化成至少八种髓系和淋巴系的血液细胞，实现机体血液、淋巴系统的正常生理功能。自我更新：通过不断的复制维持终生的造血干细胞库分类：胚肝造血干细胞；骨髓造血干细胞；外周血造血干细胞；脐血造血干细胞造血干细胞的移植骨髓移植外周血造血干细胞移植脐血造血干细胞移植：1988年，Gluckman等实施了世界上第一例脐血干细胞移植并获得成功。主要局限于小孩或体重较轻的年轻人。另创应用的瓶颈：造血干细胞的体外扩

47、增造血干细胞的转分化2001年，cell杂志报道，单个造血干细胞除重建了小鼠造血系统，还分化成肝、皮肤、肺组织。造血干细胞可以修复受损伤的心肌组织。神经干细胞 CNTFR介导的GP130信号通路和Notch1信号通路均对神经干细胞至关重要神经干细胞的应用神经干细胞分化为多巴胺神经元治疗帕金森氏症红色区域为摄取多巴胺神经元分布的区域移植多巴胺神经元后病人症状明显改善4.3.3胰腺干细胞胰腺干细胞治疗糖尿病注射胰岛素：痛苦、不便、经济负担胰腺移植、胰岛移植胰岛移植疗法及其问题组织来源紧张，现有的胰岛分离技术需要两个以上供体的胰岛才能进行移植。免疫排斥问题突出干细胞研究将有助于解决上述问题4.3.5

48、骨髓肌干细胞肌肉的生长、更新和修复是与肌纤维周围的卫星细胞有关，故认为这就是骨髓肌干细胞。4.4.4单能干细胞：肠的更新新细胞由位于小肠绒毛间,陷于肠壁保护性隐窝深处的多能干细胞所供给.干细胞的后代进行更新的方向是纵向进入绒毛，最终在绒毛的顶端死亡。死亡的细胞释放消化酶。所有未分化的人类ES细胞都能表达OCT4、SOX2和NANOG基因，然而人们还不清楚粗这些基因的确切功能。马萨诸塞州剑桥市Whitehead生物医学研究所的遗传学家Richard Young和同事们针对ES细胞内这三个基因及其编码的蛋白质进行了详细的研究。 干细胞与肿瘤的发生肿瘤是在具有无限增殖和自我更新潜能的很少一部分细胞的

49、驱动下发生的,这一部分恶性转化的靶细胞即是肿瘤干细胞(cancer stem cell)5.1 肿瘤的发生与干细胞关系密切肿瘤很可能源于干细胞干细胞与肿瘤都有较高的端粒酶活性两者均有自我更细奈何无限制的增殖能干细胞与肿瘤细胞共同的调节自我更新的信号转导途径有不同分化程度的干细胞,也有分化程度不同的肿瘤自我更新越频繁的组织,干细胞自我更新率越快,肿瘤的发生率也越高,不增生组织几乎不发生肿瘤5.2 肿瘤源于干细胞的理论依据干细胞与肿瘤细胞具有相似的自我更新调节机制肿瘤的产生是多基因突变的结果,干细胞发生多次突变的机会远比成熟的终末分化细胞高,最有可能发生多基因突变而恶变为肿瘤细胞干细胞在长期的自我

50、更新过程中一方面由于端粒长度的变短,另一方面由于端粒酶受损,导致染色体核型不稳定,产生肿瘤.肿瘤干细胞理论肿瘤干细胞是肿瘤组织中存在的一种能自我更新和增殖产生肿瘤细胞群体的细胞.按照发育生物学观点,正常情况下,干细胞分裂产生的两个子细胞,其中一个保留了干细胞特性;另一个细胞分化。而肿瘤细胞则是两个子细胞均保持了干细胞特性。肿瘤干细胞被成为恶性肿瘤细胞的种子。研究发现，诱发性皮肤癌的早期变化是由于腺囊基底部的干细胞分裂产生的两个子细胞均保持了干细胞特性。绝大多数白血病细胞根本不会致病，只有百分之一的细胞会导致发病，而且，这些罕见的致病的肿瘤干细胞与通常的干细胞有许多相似的特征。5.3 正常干细胞

51、与肿瘤干细胞比较干细胞在增殖分化过程中不被正常信号诱导变为肿瘤干细胞，而肿瘤干细胞按其遗传特性增生产生肿瘤肿瘤干细胞象成体干细胞一样具有自我更新能力，有一定程度的分化成熟能力，其自我更新和分化过程失去了正常的调控。肿瘤干细胞的不同分化程度形成了肿瘤细胞的移植性。正常干细胞与肿瘤细胞有一些相同的增殖和分化的信号调控途径一定条件下 ，肿瘤细胞内所有已表达的基因可以重新编成，肿瘤细胞可以逆转发育成正常细胞。重编程和治疗性克隆重编程：已分化的细胞恢复未分化的状态。目前多以核移植为研究手段。治疗性克隆：利用重编程过程，拜托人体胚胎干细胞研究和应用的伦理道德问题。细胞核重新变编成是指分化成熟的体细胞由分化

52、状态逆转为一种未分化状态并恢复多能性分化潜能的过程。将细胞核重新编成有三种方法：核移植，细胞融合和转录因子诱导，诱导多能性干细胞(iPS)诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞)，是借助基因导入技术将某些额特定基因导入成体细胞 ，或者同时选择性地在培养液中添加一些起辅助作用的小分子化合物，从而使体细胞去分化重编程为多潜能干细胞，此类细胞在克隆形态、生长特性、表面标志分子、基因表达模式、表观遗传学特征、体外分化潜能、畸胎瘤形成和嵌合体形成等方面与ES细胞非常相似，称为诱导多能性干细胞。6.2 体细胞种类的选择研究表明,不同细胞类型(内、外或中

53、胚层来源)，或不同分化程度（胚胎、新生或承认）的体细胞，都能被重编程，只是不同胚层来源的细胞或不同发育阶段的细胞重编程为iPS细胞的难易、效率、所需因子组合或形成克隆所需时间均不相同.从iPS诱导的过程考虑，可能与不同体细胞间的表观遗传修饰的差异相关 。不同细胞基因组的甲基化和乙酰化程度各不相同，诱导重编程过程中外源基因启动表达的要求也不同。已经证明能成功诱导产生iPS细胞的体细胞种类有：胚胎成纤维细胞，成体纤维细胞，肾上腺细胞，肌细胞，肾细胞，胎鼠干细胞，造血系细胞，干细胞，胃上皮细胞，角质形成细胞，肠上皮细胞，成熟B淋巴细胞，间充质干细胞，脑膜细胞，神经祖细胞，神经干细胞和胰腺细胞。总之，

54、在理论上人或鼠的任何一种体细胞均可被重编程为iPS细胞。皮肤成纤维细胞、血细胞（如T和B细胞等）和脂肪细胞由于取材方便，来源广泛和培养简单，是iPS细胞诱导中较为理想和常用的供体细胞类型。外源转录因子的导入方法优缺点比较优点缺点在干细胞中沉默局限于分裂的细胞，基因组整合分裂和不分裂的细胞到都导入基因组整合无病毒成分，低频率基因组整合重编程效率低，需多轮转染低频率基因组整合重编程效率低，产生四倍体控制诱导过程灵活非特异性作用，毒性不以核算为基础，直接导入转录因子某些蛋白纯化困难，半衰期短6.4外源转录因子的选择最经典和最常使用的转录因子包含Oct4,Sox2,K1f4和c-MycOct4:由Po

55、u5F1基因编码产生，含有POU结构域，是一种属于Oct蛋白家族的转录因子，参与调节多种基因，在胚胎干细胞、早期胚胎和生殖细胞中特异性表达，是维持细胞自我更新和多向分化的关键性因子。Sox2：常被作为一种多能性细胞的分子标记。在胚胎发育的早期，Sox2与Oct4在桑椹胚、内细胞团、上胚层和生殖细胞中的表达广泛重叠，提示Sox2作为协同因子参与Oct4介导的基因表达调控。Klf4：即Kruppel like factor 4，是具有结合位点特异性的锌脂蛋白转录因子，属于klf蛋白家族一员。Klf4基因在小鼠的ESCs中高表达，但是对于ESCs的自我更新和未分化状态的维持不是必需的，它对细胞的增殖

56、和分化起到重要的开关作用。c-Myc：是myc癌基因家族中最重要的一员，70%的人类癌症中都表现出c-Myc表达的失调。C-MYC基因的表达是与细胞的增殖潜能密切相关的。C-Myc已经被证明不是诱导重编程的必需因子，它在重编程中的作用可能是（1）增强细胞的增殖力；（2）调节染色质的构象，使其转变为可与Oct4、Sox2快速结合的状态。6.5转录因子的组合四个转录因子组合（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）Takahashi等通过反转录病毒载体，将4个基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）分别转入小鼠和人的成纤维细胞中，成功获得小鼠和人的iPS细胞。但是小鼠的嵌合体实验表明，导

57、入c-Myc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20%，且这一现象与外源c-Myc的再活化有关。三个转录因子组合（Oct4、Sox2和Klf4）Nakagawa等利用慢病毒载体将3个转录因子（Oct4、Sox2和Klf4）导入小鼠胚胎成纤维细胞中，获得了iPS细胞系，且由形成的嵌合体小鼠中没有发生肿瘤。但3个转录因子组合的诱导效率比4个转录因子组合低大约10倍，诱导时间明显增长。两个转录因子组合（Oct4和Sox2 或Klf4）Kim等利用慢病毒载体将2个转录因子（Oct4和Klf4）导入自身高表达Sox2和c-Myc的神经干细胞中，成功得到iPS细胞。使用反转录病毒载体 ，在丙戊酸（抑制组蛋白

58、去乙酰基酶活性）的帮助下，只用Oct4和Sox2两个转录因子能将人成纤维细胞重编程为iPS细胞单个转录因子组合（Oct4）Aoi等在小鼠神经干细胞中用反转录病毒载体只导入1个转录因子（Oct4）也获得了iPS，只是诱导成功率明显低于使用两个因子组合。6.6 IPS细胞的筛选方法Fbx15：多能性分子Fbx15特异的表达于细胞干细胞或早期胚胎中，是胚胎干细胞自我更新和发育所必需的。Nanog：因为nanog基因仅在ES细胞中特异表达，在分化的ES细胞和体细胞中不表达Oct4：Oct4基因只在全能或多能性细胞如ES细胞和EG细胞中表达，是ES细胞的一个特异标志分子。6.7 IPS细胞特点IPS细胞

59、在形态学特征、生长特性、表达标志分子、分化潜能等方面都与ES细胞基本一致，具体包含：能够形成ES细胞样的克隆、细胞核大、核质比高、碱性磷酸酶（AP）染色呈阳性、表达内源性Oct4、Sox2和Nanog，端粒酶活性提高，具有无限增殖和自我更新的能力。将iPS细胞注射到免疫缺陷鼠皮下可形成由内、中和外胚层来源的畸胎瘤将小鼠iPS细胞注射如小鼠囊胚，可发育形成嵌合体，同事，通过四倍体胚胎补偿法可获得完全由小鼠iPS细胞发育而来的小鼠在体外实验中，iPS细胞在一定培养条件下可分化形成含三个胚层来源细胞的多细胞结构IPS细胞哦能在体外定向诱导分化为神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞、多巴胺能神经元、造血

60、前体细胞、造血细胞、胰腺细胞和干细胞、分泌胰岛素的细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞和耳蜗毛细胞等各种细胞。IPS细胞的应用前景建立疾病模型迄今为止，人们已经建立了来自各种不同遗传性疾病病人的iPS细胞系（Park et al. 2008a）l型糖尿病、帕金森病、进行性肌营养不良症等.这些细胞系为在体外条件下比较正常与病理组织的形成提供了物质基础。通过体外研究这些疾病特异性的iPS细胞，有助于间接推断 疾病的发病机制及寻找有效的治疗措施自体干细胞移植同种异体移植由于供体细胞、组织和器官来源有限以及移植后的免疫排斥反应，临床应用受限。而胚胎干细胞移植除了存在免疫排斥问题，同时还要面对胚胎来