基因工程知识点

1、基因工程1、操作水平：dna分子水平目的：定向改变遗传物质或获得基因产物。理论基础：1）物质基础脱氧核苷酸2）结构基础规则的双螺旋结构3）中心法则，共用一套遗传密码2、基因工程（geneticengineering）:指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。（基因操作、遗传工程、重组DNA技术）。1973年诞生的基本用途：分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；大规模生产生物活性物质；设计、构建生物的新性状甚至新物种。3

2、、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。其核心步骤是DNA片段之间的体外连接。4、基因工程的基本形式：第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因组或染色体的转移基因组工程5、基因工程诞生的理论基础：理论上的三大发现1】证实了DNA是遗传物质；2】揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理；3】遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。6、D

3、NA双螺旋：带负电的糖-磷酸骨架在外侧，碱基在螺旋中间相互堆叠，以5一3方向反向平行关系。第二章用于核酸操作的工具酶1、寄主的限制和修饰现象：【1】作用：保护自身DNA不受限制；破坏入侵的外源DNA，使之降解。【2】入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活力。因为它们在接受新宿主甲基化酶修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。2、限制性核酸内切酶的命名：女口：Hindi属名（H）+种名（in）+株名（d）+类型（I）II型限制性核酸内切酶的基本特性：识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋

4、转对称型回文结构。*一个单位的限制酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50l反应体系中,1h完全降解1昭底物DNA所需的酶量。两种DNA甲基化酶：DNA腺嘌吟甲基化酶（dam），甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌吟N6位引入甲基.DNA胞嘧啶甲基化酶（dem），甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EeoRII等.*3、诱发星号活性产生的原因：高甘油含量5%；（2）内切酶用量过大；低离子强度；高pH；含有有机溶剂，如乙醇；2Mn/Cu/Zn等非Mg二价阳离子存在。4、DNA聚合酶I的基本性质：5一3DNA聚合酶活性；5一3的核酸外切酶活性；3一5

5、的核酸外切酶活性。切口平移法：目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。Klenow酶的基本用途：1】补平由核酸内切酶产生的5粘性末端；2】DNA片段的同位素末端标记；3】cDNA第二链的合成；4】双脱氧末端终止法测定DNA序列Klenow片段：保留5一3聚合酶活性和3一5外切酶活性；丧失了5一3的核酸外切酶活性。T4-DNA聚合酶的基本用途：1】切平由核酸内切酶产生的3粘性末端;2】DNA片段的同位素末端标记T4-DNA酶的基本特性：1】5一3的DNA聚合酶活性和3一5的核酸外切酶活性；2】在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切；3】只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；4

6、】在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位；5】外切酶活性比Klenow酶高1001000倍。反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶基本特性（用途）：1.以RNA为模板聚合cDNA链；2双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链S1核酸酶的基本反应（用途）：（来源于稻谷曲霉菌；催化反应需Zn2+和酸性条件pH4.04.5）1）内切单链DNA或RNA；2）内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA;3）在DNA上定位RNABal31核酸酶：单链内切、双链外切的核酸酶；运用于诱变育种。末端脱氧核昔酰转移酶（TdT）基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs碱性磷酸酶：来自小牛胸腺的小牛肠碱性磷

7、酸酶（CIP）;来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶（BAP）。它们都可以催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5磷酸变为5-OH末端。第三章基因工程载体1、载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子。*2、基因工程对载体的要求（理想质粒载体的必备条件）：（1）在宿主细胞内能独立复制（2）有选择性标记（3）分子量小，拷贝数多（4）有一段多克隆位点，外源DNA插入其中不影响载体的复制（5）容易从宿主细胞中分离纯化载体的基本条件：能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制；具有合适的限制性核酸内切酶位点；具有合适的选择性标记基因，用来筛选重组体DNA。载体的种类：质粒载体、噬菌体载

8、体、噬菌粒载体、黏粒载体、病毒载体、人工染色体、（柯斯质粒、动物病毒）特点：载体DNA是单个复制单元，在宿主细胞内应具有独立复制能力；含有多种限制行内切酶的单一切点；分子量尽可能小，便于细胞中分离纯化，离体条件下操作；载体内有不影响其复制，生长的非必要区域；具有多种选择性标记。*构建基因文库常用的载体：A载体系列、cosmid（柯斯质粒）载体、YAC（酵母人造染色体）、BAC（细菌人造染色体）、P1源人工载体第一节质粒载体质粒：独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中组成部分：复制必需区、选择标记基因、限制性核酸内切酶位点（克隆位点）生物学特性

9、：分子小、编码基因少、双链环状闭合。（酵母的“杀伤质粒”是RNA）空间构型：共价闭合环状DNA（SC）,呈超螺旋开环DNA（OC）,一条链上有一至数个缺口线形DNA（L构型），呈负超螺旋*电泳速率：SC-DNA最快、L-DNA次之、OC-DNA最慢二、质粒的类型1、接合型质粒:能自我转移；带有自我复制所必需的遗传信息；带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）严紧型质粒；不符合基因工程的安全要求2、非接合型质粒:不能自我转移；带有自我复制所必需的遗传信息；但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因（缺乏转移所需的mob基因），因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。如：

10、R质粒（抗性质粒）、Col质粒（大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒）弛型质粒；符合基因工程的安全要求三、质粒的复制类型-松弛型质粒:拷贝数多，有1060份拷贝严紧型质粒:拷贝数少，只有13份拷贝四、质粒载体的构建天然质粒的局限性1）分子量大，拷贝数低：第一个用于基因克隆的天然质粒PSC101，分子长9.09kb，属严紧型质粒；但只有Tetr个选择性标记；分子质量大，拷贝数低2）筛选标志不理想：ColEl质粒筛选标志是大肠杆菌素E1;colicinE1能杀死不含ColEl质粒的菌，形成“噬菌斑”。质粒载体必须具备的基本条件2）具有若

11、干个限制性内切酶的单一酶切位点4）具有复制起点（ORI）6）重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达1）具有较小的分子量和较高的拷贝数3）具有两种以上的选择标记基因5）缺失mob基因质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记抗性基因氨苄青霉素抗性（Ampr）青霉素的衍生物；通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌氯霉素抗性（Cmlr）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成，杀死生长的细菌四环素抗性（Tetr）通过与30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。链霉素抗性（Strr）通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌

12、。卡那霉素抗性（Kanr）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体：如ColE1、pMB1,适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体：如pSC101，不适合大量扩增DNA用；（3）失控的质粒载体：属温度敏感型复制控制质粒，如pBEU1、pBEU2（4）插入失活型质粒载体：载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。（5）正选择的质粒载体：如pUR2、pTR262；直接选择转化后的细胞；目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体;只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。（6）表达型质粒载

13、体：主要用来使外源基因表达出蛋白质产物第四章分子基本操作技术*1、DNA的提取方法：最常用的是碱抽提法。原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。步骤：溶菌一一破膜，蛋白质和DNA变性一一中和（用NaAc）一一离心除去沉淀一一纯化DNA（酚-氯仿抽提）一一沉淀DNA2、三种电泳的区别和适用范围【*电洗脱槽适用于回收大片段DNA】琼脂糖凝胶电泳：（水平）分离范围广，分辨率低脉冲电场凝胶电泳：适用于超大分子量的DNA电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：（垂直）分辨力

14、高，用于核酸，蛋白质分离，DNA序列分析3、核酸的分子杂交：1）Southernblot【用DNA（或RNA）探针检测DNA样品】2）Northernblot【用DNA（或RNA）探针检测RNA样品】3）原位杂交【对应的菌斑或噬菌斑位臵不变，可以直接找出阳性菌落】第六章目的基因的获取和基因文库构建第一节基因组DNA片断化1、限制性内切酶法：优点：由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点，目的基因也被切成碎片。2、随机片断化：（1）限制性内切酶局部消化法；（2）机械切割法：超声波、高速搅拌3、化学合成目的基因方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固

15、相合成法、自动化合成法。化学合成DNA片断的组装方法：互补连接法、互补延伸连接法4、寡聚核苷酸化学合成的优点：直接合成基因；合成引物（20mer左右）；合成探针序列；定点突变合成；合成人工接头或衔接物。5、目的基因的获取方法：核酸杂交法、差示杂交法、PCR筛选法、表达文库的免疫学筛选。第二节基因文库构建1基因文库：是用分子克隆方法将某种生物或其组织细胞的所有DNA片段插入适当载体，转化适当宿主菌后进行保存的克隆集合。2构建步骤：1】染色体DNA大片段的制备：物理切割法：超声波、机械搅拌；酶切法：局部消化。2】载体与基因组DNA大片段的连接：粘性末端直接连接；人工接头法；同聚物加尾。构建步骤：克

16、隆载体制备-大分子基因组DNA分离-插入片段制备-插入片段与载体连接-连接产物宿主菌转化-基因组DNA文库生成。3基因组文库的大小：一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln（l-p）/ln（1f【p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N:所需的重组载体数（克隆数）】；【或N=4.61*G/f|G为基因组大小f：基因组片段平均长度】4、cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增,称cDNA文库。以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA特点：

17、1】不含内含子序列；2）可以在细菌中直接表达；3）包含了所有编码蛋白质的基因；4）比DNA文库小的多，容易构建。构建步骤：1】总RNA提取（商业化的试剂盒kit）；（2）mRNA的分离纯化（纤维柱，NaCl洗脱）3）cDNA的合成：cDNA第一链合成降解mRNA模板cDNA第二链合成去掉发卡结构构建步骤：mRNA的提取-cDNA克隆载体的选择-cDNA克隆片段的获得-cDNA文库的生成。cDNA文库的大小：N=n（l-P）/（1-1/n）【p：文库包含了完整mRNA的概率（99%）;1/n低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例；N：所需的重组载体数（克隆数）】第七章基因的体外

18、重组与转移1、粘性末端的连接：两段DNA的连接；DNA片断与载体的连接2、平头末端的连接：（1）直接连接；人工加尾形成粘性末端同聚加尾法原理：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸优点：能把任何片段连接起来。缺点：不能把插入片段再切下来。衔接物（linker）连接一优点：可以用内切酶把插入片段切下来；能给载体连接上Polylinker。缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段。DNA接头连接法优点：连上后就能用。缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。防止自我连接：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的

19、磷酸，防止自我连接3、DNA体外连接应注意的事项1】插入片断与载体的酶切位点互补：（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切2】DNA插入的方向正确：用双酶切3】插入基因的开放阅读框（ORF）正确：（1）DNA定向插入（2）起始密码4、防止载体自身环化连接：（1）用碱性磷酸酶处理线性载体分子（2）提高插入片断的用量（3）采用同聚物加尾连接技术（4）CIP处理（5）使用同尾酶产生的黏性末端连接方法碱性磷酸酶的作用：防止载体自身环化连接，增加重组克隆的数目。5、载体和外源DNA插入片段的连接结果载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片

20、段重组（能存活）5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）第二节基因转移1、感受态细胞：就是受体细胞处于摄入外源DNA的状态。（无特异性，对各种外来DNA都可接收）感受态大肠杆菌的制备目的：增加受体菌细胞膜的通透性。制备原理：用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性制备过程：培养大肠杆菌OD6OO至0.30.4一冰浴5-10min4C离心收集菌一用冰冷的60mMCaC12重悬4C离心收集菌一用冰冷的60mMCaC12重悬Onice30min4C离心收集菌一用冰冷的60mMCaC12重悬一分装、-70C冻存2、外源DNA导入细菌的几种方法（1）转化大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染大肠杆菌

21、捕获噬菌体DNA的过程。（3）转导借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。转化方法：1】化学转化法；2）电转化法（转化效率高，高于109/ygDNA）;3】热休克法（简单，但转化效率不高）转化率：每昭DNA转化成功的细菌克隆数。影响转化率的因素：1）重组质粒（环形质粒数）：1.环形重组质粒2.质粒自我连接。（线性载体或DNA片断进入细菌会被降解）2）感受态细胞：生长状态（使用对数生长期的菌）；必须在冰冷的条件下制备；储存感受态菌要在70C以下；CaC12处理，使细菌细胞膜失去一些蛋白；使用感受态菌时必须迅速融化（融化后一般不能再次冻存使用）第八章重组体克隆的筛选和鉴定一、抗药性标记及其插入失活选

22、择法原理：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和Sa1I;Ampr上有插入位点PstI。2、pBR322抗菌素标记选择（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。（2）氨苄青霉素抗性基因：产生卩-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（蓝灰色）褪色。（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。*3、选择过程：（1）四环素抗性插入失活：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗

23、四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素指示液选择。二、A半乳糖昔酶显色反应选择法1、原理：载体上有一段&半乳糖昔酶基因（LacZ）的a片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的卩-半乳糖昔酶基因（a片段缺失），可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的卩-半乳糖昔酶。2.选择过程中，卩-半乳糖昔酶使Xgal分解成兰色产物假阳性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏a肽）。2、DNA电泳检测法：直接电泳检测法；酶切电泳

24、筛选法；PCR扩增检测法；核酸杂交检测法；免疫化学检测法核酸杂交检测方法：（1）Southernblotting：用DNA（或RNA）探针检测DNA样品原位杂交筛选【对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落】R-环检测法【原理为DNA-RNA杂交；用外源基因的mRNA与重组载体杂交；缺点为需要电镜】（2）Northernblotting：用DNA（或RNA）探针检测RNA样品；主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA,再用探针杂交。3、免疫化学检测法：放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、Western印记分析法。免疫沉淀检测法：检测分泌型产物；原理是抗原抗体凝集反应；TK选择过

25、程：HAT培养基：次黄嘌吟、氨基喋啉和胸昔的培养基宿主细：Tk-细胞株。载体标记：TK基因。只有转入TK基因的细胞才能生存氯霉素乙酰转移酶（CAT）：CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。选择条件：含氯霉素的完全培养基。宿主细胞：真核细胞株均可。载体标记：cat基因CAT分析方法：分析乙酰氯霉素；免疫学检查。第十章外源基因的表达1、外源基因：|原核或噬菌体启动子+SD序列+MCS+终止子表达载体组成：启动子+操纵子+SD系列+目的基因+终止子*最佳启动子必须具备的条件：必须是一种强启动子；应呈现低水平的基础转录，便于表达毒性蛋白；应是可诱导型的。2、常用的表达载体：非

26、融合型表达蛋白载体pKK223-3具有一个强的tac启动子条件：必须选择一个有lacl的宿主菌。组成结构：强启动子:tac(trp-lac):trp的-35区lacUV5的-10区；操纵基因：乳糖操纵子系统lac操纵基因调节基因宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统，如JM105菌；终止子：rrnB的强终止子；S-D序列和插入位点区；载体的其余部分：来自pBR322质粒；表达诱导物：IPTG(乳糖的类似物，不会被降解)分泌型克隆表达载体pIN皿系统：以pKK223为基础构建的，调节基因不必借助宿主的lacl.；直接分泌到固质中。载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质

27、中。如:pINIII系列组成结构：强启动子：Ipp(脂蛋白基因启动子)和lacUV5启动子；调节基因lacI:S-D序列和起始密码ATG；分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa；插入位点区(多克隆位点)。pINIII-comA1以pBR322为基础构建的。融合蛋白表达载体pGEX系统表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。优点：便于融合蛋白的分离和纯化组成结构：启动子tac操纵基因lacP调节基因lacIS-D序列ori:pBR322ori融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)3、影响外源基因表达效率的因素：1】启动子的结构对表达效率的影响：一致顺序-35box-5-TT

28、GACA-3RNA聚合酶e亚基的识别位点；-10box(PribnowBox)5-TATAAT-3。-35与-10区间的距离：间隔为17bp时，启动子最强；(3)-35和-10区碱基顺序：越接近一致顺序，启动子越强。2】转译起始序列对表达效率的影响S-D序列：S-D序列后面的4个碱基：如果是A(T),翻译效率最高；如果是G(C),效率只有50%或25%。起始密码AUGAUG左侧的三个碱基也有影响。卩-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。其它多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋

29、白mRNA的核糖体结合位点有多个U。3】启动子与外源基因之间的距离4】转录终止区对表达效率的影响转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。5】载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。6】外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响真核或病毒启动子+MCS+PolyA信号+终止子外源基因：第二节外源基因在真核细胞中的表达酵母克隆载体：(1)整合型载体(Yp)由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记)构成。如PYeleulO|ColEl+酵母Leu2+特点：转化率低(1-10转化子/微克DNA)。不能在酵母

30、细胞中自主复制载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。整合到酵母的染色体上可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。不能从酵母细胞中提取载体。复制型载体(YRp)由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS)构成。大肠杆菌质粒+酵母ARS+酵母选择标记特点：转化率高(102-103转化子/微克DNA)。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。穿梭载体(shuttlevector)能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。不稳定，容易丢失。着丝粒质粒(YCp)在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。叭质粒+酵母着丝粒特点：行为像染色体，能稳定遗传。单拷贝存

31、在。不易从细胞中提取。附加体型载体(YEp)由大肠杆菌质粒、2ym质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。如pYF92大肠杆菌质粒+2ym质粒+酵母选择标记特点：很高的转化活性(103-105转化子/微克DNA).拷贝数多(25-100分子/细胞)。比YRp稳定。第十一章植物基因工程1、Ti质粒：是根癌农杆菌染色体外/核外的一种闭合环状双链DNA分子，约200kb。类型：章鱼碱型(nos)、胭脂(ocs)、农杆碱型和农杆菌素碱型结构功能区域：毒性区(Vir区)：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒D

32、NA的三分之一。T-DNA区是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA,故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。NOC是编码细菌利用胭脂碱的基因(TL-DNA)为13kb的单拷贝序列，是诱发和维持肿瘤所必需的。(TR-DNA)为7kb的多拷贝序列。接合转移区(Con区)(regionsencodingconjugations):该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因(tra),调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，从而使肿瘤扩散。复制起始区(Ori区)：该区段基因调控Ti质粒的自我复制起始。2、T-DNA转移至植

33、物细胞的过程可分为：1.农杆菌对植物细胞的识别和附着；2.农杆菌对植物信号物质的感受；3.农杆菌vir基因的活化；T-DNA复合体的产生；5.T-DNA复合体的转运；6.T-DNA整合到植物基因组中。*植物受伤后能分泌酚类化合物诱导Ti质粒上的毒性基因表达。3、植物基因工程载体命名规则：天然存在的质粒第1个字母大写，并用括号括起来，如口(ColEl)。重组质粒用小写p(Plasmid)后加两个大写字母表示：大写字母指构建质粒的研究人员或完成此项工作的研究机构,如：pSCl0l:SC(StanleyCohen人名),pMT555:MT(ManchesterTechnology)曼彻斯特理工学院。农杆菌中的质粒一般在命名中要表示出来。如pTiT37,Ti表示根癌农杆菌，T37表示质粒编号或分类。*1、请模仿多利羊的克隆过程，设计克隆大熊猫的方案，并回答相关问题（1）从A大熊猫的主要性器官卵巢中取出一个卵细胞，去除细胞核（2）从B大熊猫的体细胞中取出一个细胞，取出